第二章 生物制药工艺技术基础1课件.ppt

（2）富集培养 收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。若含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利筛选。 再配合控制温度、pH或营养成分即可达到目的。 （3）菌种的纯化 在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生长，所以要进行分离，以获得纯种。 菌种纯化的方法一般采用稀释分离法或划线分离法。 2、菌种的筛选 筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。 当提取物由固相转入液相或从细胞内转到细胞外时，提取率还与物质的扩散作用有关。为了提高提取速度，常采取一些措施，如增加材料的破碎程度，进行搅拌，延长提取时间，提高提取温度。 （三）影响提取效率的因素 1、温度 多数物质的溶解度随提取温度的升高而增加。另外较高的温度可以降低物料的黏度，有利于分子扩散和机械搅拌。 应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较低的温度下进行提取，一方面是为了减少溶剂挥发损失和生产安全，另一方面也是为了减少活力损失。 2、酸碱度 多数生化物质在中性条件下较稳定，所以提取用的溶剂系统原则上应避免过酸或过碱，pH一般应控制在4～9范围内。为了增加目的物的溶解度，往往要避免在目的物的等电点附近进行提取。 巧妙地选择溶剂系统的pH，不但直接影响目的物与杂质的溶解度，还可以抑制有害酶类的水解破坏作用，防止降解，提高收得率。 3、盐浓度 盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力。稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。 一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中能增加溶解度，这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增加，水合作用增强，促使形成稳定的双电层，此现象称“盐溶”作用。 多种盐溶液的盐溶能力既与其浓度有关，也与其离子强度有关，一般高价酸盐的盐溶作用比单价酸盐的盐溶作用强。 常用的稀盐提取液有： 氯化钠溶液（0.1～0.15mol／L）； 磷酸盐缓冲液（0.02～0.05mol／L）； 焦磷酸钠缓冲液（0.02～0.05mol／L）： 醋酸盐缓冲液（0.10～0.15mol／L）： 柠檬酸缓冲液 （0.02～0.05mol／L）。 其中焦磷酸盐的缓冲范围较大，对氢键和离子键有较强的解离作用，还能结合二价离子，对某些生化物质有保护作用。 柠檬酸缓冲液常在酸性条件下使用，作用近似焦磷酸盐。 （四）提取方法的选择 生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、相对密度、粒度、黏度、目的物含量、主要杂质种类及溶量解性质、有关酶类的特征等。 操作者可根据文献资料及本人的试验探索获得有关信息，在提取过程中尽量增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度，同时充分重视生物材料及目的物在提取过程中的活性变化。 对酶类药物的提取要防止辅酶的丢失和其他失活因素的干扰； 对蛋白质类药物要防止其高级结构的破坏（即变性作用），应避免高热、强烈搅拌、大量泡沫、强酸 强碱及重金属离子的作用。 多肽类及核酸类药物需注意避免酶的降解作用，提取过程中，应在低温下操作，并添加某些酶抑制剂； 对脂类药物应特别注意防止氧化作用，减少与空气的接触，如添加抗氧剂，通氮气及避光等。 在提取过程中，如蛋白质、酶及核酸类药物常采用下列保护措施。 （1）采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团的解离导致溶液pH的大幅度变化，使某些活性物质变性失活或因pH变化影响提取效果。 在生化药物制备中，常用的缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等， 所使用的缓冲液浓度均较低，以利于增加溶质的溶解性能。 （2）添加保护剂 防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受破坏，如巯基是许多活性蛋白质和酶的催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸、β－巯基乙醇、二巯基赤鲜糖醇、还原型谷胱甘肽等。 其他措施如提取某些酶时，常加入适量底物以保护活性中心。对易受重金属离子抑制的活性物质，可在提取时添加某些金属螯合剂，以保护活性物质的稳定性。 （3）抑制水解酶的作用 抑制水解酶对目的物的作用是提取操作中的最重要保护性措施之一。 如需要金属离子激活的水解酶（如DNase）常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液，使水解酶活力受到抑制。 对热不稳定的水解酶，可用热变性提取法，使酶失活。 根据酶的溶解性质的不同，可用pH不同的缓冲体系提取，以减少酶的释放或根据酶的最适pH，选用酶发挥活力最低的pH进行提取。 最有效的办法是在提取时，添