第二章 生物制药工艺技术基础2课件.ppt

（2）通过PCR技术制备目的基因 ① PCR基本原理 PCR技术可在短时间内于试管中获得数百万个特异DNA序列的拷贝。它实际上是在欲扩增的目的DNA的两侧设计一对正向和反向引物，在模板DNA以及四种脱氧核糖核酸（4dNTPs）底物存在的条件下由TaqDNA聚合酶所引导催化的DNA扩增酶促反应。 PCR由3个基本反应组成： a、高温变性。通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。 b、低温退火。使温度下降，引物与模板DNA中所要扩增的目的序列的两侧互补序列进行配对结合。 c、适温延伸。在TaqDNA聚合酶、4dNTPs及Mg2＋存在下，引物3′端向前延伸，合成与模板碱基充列完全互补的DNA链。以上变性、退火和延伸便构成一个循环，数小时之后（约25～30次循环），介于两引物间的目的DNA片段便可扩增105～107拷贝（图2－ 11）。 通过在引物的5′端添加额外的与模板不互补的所需DNA序列，如限制性酶切位点、起始密码子、核糖体结合位点、启动子、终止密码及终止子等，便可以将其引入目的基因中，从而方便进行目的基因的克隆、表达与调控研究。 （3）人工合成目的基因 最简单的办法就是首先利用化学合成法分别合成两条互补的寡核苷酸链，然后让这两条链在适当条件下退火，形成双链。但是这种方法仅限于合成组装较短的基因（60～80bp），这是由于随着寡核苷酸链合成长度的增加，出错率也会增加，同时产物的得率也会下降。 人们尝试采用了多种人工基因组装方法（图2－ 12）。 2、重组子的构建 目的基因必须与载体连接形成一种重组DNA分子，并转入相应的宿主细胞后才能实现目的基因的克隆与表达。 根据目的基因片段的来源与类型不同，可以采取不同的连接策略，目前应用较多的连接方式有3种：黏端连接、平端连接和TA克隆。 （1）黏端连接 黏端连接是指目的基因与载体之间具有彼此互补的黏性末端，在较低的温度下可以形成氢键，再通过T4DNA连接酶便可以连接成完整的重组DNA分子。 （四）微生物的培养方法 将微生物接种于培养基中，在特定的条件下增殖，此过程称为培养。特定条件一般是指温度、通气、pH和培养基组成。 1．培养装置 （l）恒温箱 它是将微生物保持在一定温度进行培养的器具。可用于斜面和平板静置培养。 （2）振荡培养器 用于好气菌的液体培养。①旋转式振荡器：三角烧瓶。②往复式振荡器：试管、三角烧瓶等。③独臂振荡器：L型管。 （3）其他 对于嫌气菌或分解气体菌的培养，使用密闭型或能够交换气体的容器。 大量液体培养使用发泡塔、发酵桶、发酵罐。特殊装置。 2．培养方法 （1）固体培养法 ① 斜面培养。对于细菌、酵母，用接种针在斜面培养上划一条直线或全面涂抹；对于霉菌，则取一部分孢子或菌丝体在斜面上划成弯曲钩状，然后进行培养。 ② 平板培养。对于细菌、酵母，在平板培养基上适当涂抹，对于霉菌，接种时要将平板反过来，从下轻轻一点即可，然后再翻过来培养。 ③ 穿刺培养。常用于嫌气菌（乳酸菌等）的保藏或明胶的液化试验等。它用接种针对深层培养基穿刺接种后培养，若是产生气体的菌会发生龟裂现象。 ④ 其他固体培养法。此类培养为用米曲、马铃薯和面包进行的培养。 （2）液体培养法 ① 静止培养法。一般用于酵母、嫌气性细菌、兼性嫌气性细菌的培养以及各种生理试验等。对于霉菌也可在液体培养基中使用称作表面培养的静置培养法。 ② 振荡培养法。这是实验室最常使用的好气性菌、兼性菌的液体培养法。 为提高搅拌效果，增加通气量，可在装有档板的烧瓶内培养，此时必须控制液量不要使塞弄湿，因为塞沾湿后易污染杂菌，并同时降低通气效果。试管振荡器主要用于菌种筛选等大量菌株的处理。 ③ 通气搅拌培养法。在发泡塔、发酵桶、发酵罐等容器内的培养，均采用通气搅拌式的大规模培养。 三、发酵过程的控制 （一）发酵过程的主要控制参数 1、物理参数 （1）温度（℃） 指发酵整个过程或不同阶段所维持的温度。 （2）压力（Pa） 这是发酵过程中发酵罐维持的压力。罐内维持正压可以防止外界空气中的杂菌侵入而避免污染，以保证纯种培养。 （3）搅拌转速（r／min） 指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每lmin的转速来表示，它的大小与氧容量传递速率与发酵液的均匀性有关。 （4）搅拌功率（kW） 指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每lm3发酵液所有消耗均功率（kW/m3）。它的大小与氧容量传递系数KLa有关。 （5）空气流量［L／（L·min）］空气流量是每1min内每