第二章第二节 基因克隆的载体课件.ppt

二 噬菌体载体 （phage vectors） 1、?噬菌体的生物学特性 2、 ?噬菌体载体 3、M13噬菌体的生物学特性 4、M13噬菌体载体 4. M13噬菌体载体 后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。 载体中含有LacZ基因及位于其中的多克隆位点，所以能通过?互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等。 这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段 第二节 基因克隆的载体 引 言（introduction） 一 质粒载体（plasimid vectors） 二 噬菌体载体（phage vectors） 三 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 三 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 柯斯质粒载体的特点 柯斯质粒是一类人工构建的含有?DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。 柯斯质粒的大小为4-6kb， 由3部分组成： A.多克隆位点区 B. 含有cos位点的?DNA区 C. 复制起始位点和抗性标记区 pHC79 Ori Marker MCS cos ?DNA 三 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 柯斯质粒载体的特点 1、具有?噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。 2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。 3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。 三 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 柯斯质粒载体的应用 ?噬菌体的位点特异切割体系——末端酶（terminase）体系要求两个cos位点间要保持38-54kb的距离。 下面的操作中缺点是：cosmid自我重组、外源DNA片段串联 后重组。 Ori Marker MCS cos ?DNA 三 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 柯斯质粒载体的应用 1981年，Ish-Horowics和Burke设计了一种特殊的克隆方案，在所用的质粒上的BamHI位点的两侧各有一个EcoRI位点包围着。这样在BamHI位点克隆的DNA片段可以用EcoRI重新切割下来。 cos HindIII BamHI Sal I Sal I HindIII 磷酸化酶 Sal I BamHI BamHI HindIII BamHI BamHI Sal I HindIII Sau 3A 磷酸 化酶 32-47 kb 小 结 第二节 基因克隆的载体 引 言（introduction） 一 质粒载体（plasimid vectors） 二 噬菌体载体（phage vectors） 三 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 基因工程的基本步骤 基因分离酶切 载体酶切 基因和载体连接 导入细菌 重组质粒繁殖 重组克隆的选择 序列分析和基因表达等研究 导入植物细胞 ③EDTA Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。 ④NaOH-SDS NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 用冰醋酸将醋酸钠溶液的pH调到4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 用于沉淀DNA。 ⑥ 乙醇 DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 ⑤ NaAc-HAc缓冲液 ⑦ RNase A 降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 ⑧ TE缓冲液 DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。 Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利