第五章 酶与细胞的固定化技术课件.ppt

第五章 酶与细胞的固定化技术 固定化酶 固定化酶：是指借助物理或化学方法将酶固定在载体上，并在一定的空间内进行催化反应的酶。固定化酶可以连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。 固定化酶形状：颗粒、线条、薄膜和酶管等。 固定化菌体 优点：1）可提高稳定性；2）能回收，易与产物分离，可反复使用；3）可连续化生产操作；4）可实现最优化控制；5）酶可以再生利用。 缺点：1）酶固定化后酶活力有损失；2）只能用于可溶性小分子底物；3）与完整细胞比较，不适于多酶反应。 制备固定化酶的依据 固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度。 固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即要保护活性中心基团。 固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产量。具有最小的空间位阻。 固定化酶应有最大的稳定性。 定化酶应易与产物分离。 酶的固定化方法 优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解吸附。 固定化酶性质 固定化对酶稳定性影响：1）对热稳定性提高；2）对变性剂、抑制剂的耐受性提高；3）对蛋白酶抵抗能力增加、储存稳定性和操作稳定性有所增强。 最适温度：一般与游离酶相似。 最适pH：受载体带电性和产物性质等最适pH会受一定影响。 底物特异性：是否变化与底物的分子质量大小有一定关系。 米氏常数：固定化酶的表观米氏常数随载体带电性能而变化。 固定化酶操作的注意事项 活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。 固定化酶（细胞）的评价指标（一） 固定化酶（细胞）活力：固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 通常采用间歇测定和连续测定方法。 蛋白总量：1）双辛可宁酸法(BCA法) ；2）考马斯亮蓝法 。 半衰期：在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示，是衡量稳定性的一项重要指标。 固定化酶（细胞）的评价指标（二） 偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100% 活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100% 相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)×100% 1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器——葡萄糖氧化酶电极。 继酶传感器（enzyme sensor）后，又出现： 细胞器传感器（cell organelle sensor） 组织传感器（tissue sensor） 微生物传感器（microbe sensor） 免疫传感器（immunosensor） 1）酶传感器的原理 生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。 生物识别元件(Biological recognition element) 是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。 换能器(Transducer) 将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。 2）酶传感器的应用 水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。 从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物。 食品鲜度 鱼鲜度传感器：在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。 鲜度可用K值表示：K=肌苷+次黄嘌呤/ ATP +ADP+AMP+IMP +肌苷+次黄嘌呤+尿酸 大多数鱼死后5～20h，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP--肌苷---次黄嘌呤---尿酸。 将这三个步骤的三种酶（5’－核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。 当K＜20时，鱼极新鲜，可供生食。 K在20～40之间为新鲜，必须熟