RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型的建立.docVIP

RNA干扰致FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型的建立 　　[摘要] 目的 利用shRNA表达载体建立FRAT1基因沉默结肠癌HT29细胞模型。方法 将化学方法合成的特异性FRAT1基因siRNA，以人类结肠癌HT29细胞为实验对象，采用Lipofectamine将FRAT1基因的shRNA表达载体导入细胞后，用RT-PCR和Western blot检测目标基因FRAT1的表达水平。结果 稳定转染FRAT1 shRNA表达载体（pSINsi-FRAT1）后，FRAT1基因在mRNA和蛋白质表达水平分别下降92.63%、55.72%（P0.05）。结论 成功地建立了FRAT1基因沉默HT29细胞模型，为研究FRAT1生物学功能打下坚实的实验基础。 　　[关键词] FRAT1；结肠癌；转染；RNA干扰 　　[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）03（b）-0012-05 　　人FRAT1（frequently rearranged in advanced T cell lymphomas-1）基因最初被认为是T细胞淋巴瘤的原癌基因，是FRAT（frequetly rearranged in advanced T cell lymphomas）家族中的一员[1-2]，研究表明FRAT1基因过表达在肿瘤发生中起关键作用，并已证实人结肠癌细胞存在FRAT1基因的高表达[3]。 　　RNA干扰（RNA interference，RNAi）是目前应用在逆向遗传学（reverse genetics）研究中高效的基因沉默技术，在功能基因组学和基因治疗的研究中得到广泛应用。RNAi技术可以关闭变异基因的表达，尤其是shRNA的应用，可对基因表达产生稳定强大的干扰效应，为肿瘤治疗提供了良好前景[4-5]。已有研究证明，利用RNAi技术特异性下调肿瘤细胞内高表达的癌基因或者抗凋亡基因，可使癌细胞对化疗和放疗的敏感性增加，抑制癌细胞的增殖，促进癌细胞凋亡，从而提高抗肿瘤效应[6-7]。本实验选择结肠癌HT29细胞株作为实验对象，通过转染化学合成的FRAT1 shRNA表达载体，建立长期稳定表达FRAT1shRNA的实验细胞模型，以期为研究FRAT1基因在结肠癌发病过程中的作用机制及基因治疗打下坚实的实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂与细胞培养 　　1.1.1 实验试剂 载体pSINsi-hu6购于大连宝生物公司，转染试剂Lipofectamamine（11668-脂质体2000）购于Invitrogen公司；筛选试剂G418（11811-023）购于美国Gibco公司；cDNA合成试剂盒，PCR试剂盒（上海生物工程公司）；引物（ULTRA PAGE）由上海生工生物工程股份有限公司合成；人结肠癌细胞株HT29（KG015）于南京凯基生物购买；DMEM培养基干粉DMEM高糖-Y）为Gibco产品；胎牛血清（TBD21HB）购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；FRAT1兔抗人多克隆抗体（sc-130756）购自Santa cruz 生物公司；HRP标记山羊抗兔二抗（AB10058-Peroxidase-conjugated AffiniPure）购自碧云天生物技术研究所；ECL试剂盒从GE 医疗集团购买。 　　1.1.2 细胞培养 HT29细胞株（购自南京凯基细胞库）为本实验室保存，细胞复苏后用不含抗生素的培养基（DMEM+10%FBS）培养。 　　1.2 方法 　　1.2.1 设计和合成siRNA及表达shRNA的DNA模板链 FRAT1基因siRNA序列 CTF182-1-1（序列GCAGTTACGTGCAAAGCTT）；其阴性对照序列为CTF182-N-1（序列TCTTAATCGCGTATAAGGC）。序列GCAGTTACGTGCAAAGCTT用于设计和合成针对FRAT1基因的shRNA。表达FRAT1 shRNA的DNA模板包括两条链siRNA-sense：5′-GATCCAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCTGTGAAGCCACAGATGGGAAG CTTTGCACGTAACTGCTTTTTTTAT-3′；siRNA-antisense：5′-CGATAAAAAAAGCAGTTACGTGCAAAGCTT CCCATCTGTGGCTTCACAGAAGCTTTGCACGTAACT GCTG-3′，其中Sense中的斜体部分为BamH Ⅰ酶切位点，Antisense中斜体部分为Cla Ⅰ酶切位点。下划线部分为干扰序列及其配对序列，曲线部分为loop环形成序列。双链FRAT1siRNA和无功能siRNA均由大连宝生物公司合成。