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RP—HPLC测定桑叶中绿原酸的含量 　　[摘要] 目的 建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定桑叶中活性成分绿原酸的方法。 方法 采用Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）色谱柱；流动相为乙腈-1.0%醋酸水溶液，采用梯度洗脱，检测波长为325 nm，流速1.0 ml/min，柱温30℃，进样体积10 μl。 结果 绿原酸的线性范围为0.3890～7.771 ？滋g（r=0.9994），平均回收率为98.91%。 结论 RP-HPLC检测效率高，专属性强，重复性好，可用于桑叶中绿原酸的定量测定，可作为该药材的质量控制方法之一。 　　[关键词] 桑叶；绿原酸；质量控制；反相高效液相色谱法 　　[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0017-03 　　桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，初露后采收，除去杂质，晒干，具有疏散风热，清肺润燥，清肝明目之功效。主要用于风热感冒，肺热燥咳，头昏头痛，目赤昏花[1]。现代药理研究表明桑叶具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等功效[2-4]。对桑叶的质量控制研究大部分围绕中桑叶中的活性成分芦丁来进行相应的含量测定[5-6]，也有的围绕黄酮类成分进行相应质量控制研究[7]。目前，国内外市场对桑叶的需求愈来愈大，且本课题组在前期指纹图谱研究中发现绿原酸也是桑叶中的主要活性成分之一[8]，因此为了进一步控制桑叶质量，本研究采用反相高效液相色谱法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）对从全国收集的桑叶药材进行绿原酸含量测定研究，现报道如下。 　　1 仪器与试剂 　　1.1 仪器 　　KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BPZ11D型电子分析天平（Sartorius公司）；Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器（Waters 公司）。 　　1.2 试剂 　　甲醇（色谱纯，TEDIA公司），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水，冰乙酸（色谱纯，北京化工厂）。 　　1.3 对照品及样品 　　对照品绿原酸购于中国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号110753-200413），不同产地的桑叶药材，均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授鉴定为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱条件 　　色谱柱为Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm；柱温：30℃；进样体积：10 μl；流动相：乙腈（A）-1.0%醋酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序：0→20 min，9%A→18%A。按照上述色谱条件，待测成分绿原酸分离很好，无干扰，得色谱图1。 　　2.2 供试品制备 　　取桑叶粉（80目）约1 g置50 ml三角瓶，精密称定，加甲醇20 ml，称重，超声30 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，静置，放凉，补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，RP-HPLC分析。 　　2.3 对照品制备 　　精密称取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解，定容，得到浓度为0.3890 ？滋g/？滋l的对照品溶液。 　　2.4 标准曲线的绘制 　　分别精密吸取“2.3”项下的绿原酸对照品溶液1、3、5、8、10、15、20 ？滋l进样分析，记录按上述色谱条件测定的峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样体积（？滋l）为横坐标（X），得绿原酸的线性回归方程分别为：Y=182 283X-131 274（r=0.9994，0.3890～7.771 ？滋g）。 　　2.5 精密度 　　取同一供试品溶液，按上述RP-HPLC分析条件，连续进样6次，计算绿原酸峰面积，结果表明，峰面积RSD值0.65%。 　　2.6 重现性 　　一份固定粉末样品，平行制备6份供试品溶液，进行RP-HPLC分析，考察绿原酸峰面积，峰面积的RSD值1.02%，表明方法的重现性在误差范围内。 　　2.7 稳定性 　　制备药材供试品溶液后，在室温下放置不同时间，分别于0、1、2、4、8、12、24、48 h进行RP-HPLC分析，以绿原酸的峰面积计算，考察样品的稳定性，主要成分的峰面积在48 h内RSD值1.24%，表明样品至少在48 h内是稳定的。 　　2.8 回收率试验 　　取同一批已知含量的桑叶药材样品约0.5 g，精密称定，分别精密加入一定量绿原酸对照品溶液，按“2.2”项制成加样供试品溶