第十一章：基因工程的基本概念和基本原理方案.ppt

产量高、工厂化生产、满足患者需要 产量低、价格高、供不应求 比较 100克/1000升培养液 4—5克/100千克 产量 大肠杆菌工程菌分泌 猪、牛胰腺提取 来源 基因工程 传统方法 胰岛素生产 胰岛素：是治疗糖尿病的特效药。 干扰素：是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白；来源于被病毒感染的组织细胞产生（非病毒基因表达产物）。 它是一种抗病毒的特效药； 几乎能抵抗所有病毒引起的感染； 干扰素对治疗乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌症和某些白血病也有一定疗效。 功能： 基因工程方法生产产量高、效果稳定、成本低，适于工厂化生产 比较 20～40mg干扰素/1kg细菌培养物 1mg干扰素/300L血液 产量 大肠杆菌及酵母菌细胞内获得 从人血液中的白细胞内提取 来源 基因工程方法 传统方法 干扰素生产 用于基因诊断与基因治疗，基因工程技术还可以直接用于基因的诊断和治疗。目前用基因诊断方法已经能够检测出肠道病毒、单纯疱疹病毒等许多种病毒。 基因诊断：用放射性同位素（如32P）、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。 把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。 基因工程与农作物育种 获得高产、稳产和具有优良品质的农作物 培育出具有各种抗逆性的作物新品种 抗除草剂大豆 普通棉花 兔毛转基因棉花 Nicotine-free tobacco is now being grown for a projected introduction of nicotine-free cigarettes Northern blot 与Southern的不同在于以RNA为研究对象，并且对RNA进行变性电泳，在分离RNA的同时消除RNA的二级结构。 主要有：甲醛变性电泳、 菌落（或噬菌斑）杂交 细菌转化 转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 大肠杆菌的转化 在0℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态。此外，Ca2+ 能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，这种复合物便会被细胞吸收。 细菌的转化频率受多种因素制约： 转化DNA的浓度、纯度和构型 转化细胞的生理状态及其在CaCl2处理和贮藏之后的存活率 转化的环境条件，如温度、pH值、离子浓度等 DNA核苷酸序列分析 末端终止法（双脱氧法）测序：Sanger设计 Fluorescent DNA sequencing 测序仪输出的结果图 DNA序列分析的自动化 “分析反应”的自动化。 “读片过程”的自动化，这个问题的解决颇费力量，目前仍在研究改进之中 1986年安索吉等人在他人工作的基础上，设计的DNA序列分析自动仪，其工作原理是用四甲基若丹明作为唯一的荧光剂，预先标记M13引物DNA。 基因的化学合成 磷酸二酯法 1979年Khorana及其同事创立和发展的，并利用该方法成功合成了一种具有生物活性的大肠杆菌酪氨酸转移核糖核酸基因。 原理：是将一个5’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与另一个3’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。 在磷酸二酯法中，由于产物为磷酸二酯，磷酸上所剩下的OH基团，虽然化学活性较小，但也能发生反应，因此，当合成的寡核苷酸链逐渐增长时，由这个磷酸OH基团所带来的副反应也愈益严重，使合成产率急剧下降。目前这个方法已基本上被淘汰，改进的办法之一是采用适当的保护基把磷酸上的OH基团也保护起来，再进行连接反应。 磷酸三酯法 原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了一个保护基团。因此合成的二核苷酸连接处有三个酯键。 固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。它是将第一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。固相磷酸三酯合成过程如图： 固相亚磷酸三酯法 以保护的亚磷酰胺单体为原料，经1-H-四氮唑活化后与羟基组分连接，先生成亚磷酸三酯，再氧化得到磷酸三酯，称为亚磷酰胺法或亚磷酸三酯法。 基因工程的成果 基因工程与医药卫生 生产基因工程药品：如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等。基因工程药品是制药工业上的重大突破。 第三节、基因工程的成果和发展前景 传统药品生产：直接从生物体的组织、细胞或血液中提取的；原料有限，产品价格昂贵。如：猪胰岛素，紫草素 工程菌生产：通过发酵工程生产；高效率、高质量、低成本的药品。如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等； 传统药品