中国男性不育患者CFTR基因M470V检测及其意义.docVIP

中国男性不育患者CFTR基因M470V检测及其意义 　　【摘要】 目的：明确我国生育力正常男性人群和男性不育人群中的CFTR基因M470V多态性分布情况，以探讨CFTR基因M470V多态性改变与男性不育之间的关系。方法：知情同意的情况下收集临床诊断明确的非梗阻性无精子症患者67例、先天性双侧输精管缺如患者95例，以及因女方因素拟行试管婴儿助孕、精液常规检查正常的男性135例。外周血基因组DNA抽提，应用Cycling probe法检测M470V SNP类型，应用SPSS 13.0进行数据分析，使用卡方检验，P0.05）。MV基因型为最常见的基因型，在生育力正常男性人群中的基因型频率为0.4296，其次为VV基因型，基因型频率为0.3704，最少见的为MM基因型，基因型频率为0.2。MM、MV、VV基因型在生育力正常男性人群中的分布符合哈迪-温伯格平衡定律（χ2=1.7871，P=0.1813，P0.05）。V470等位基因为生育力正常男性人群中最常见的等位基因，其等位基因频率为0.5852，M470等位基因与V470等位基因在生育能力正常的男性人群中的分布比例约为0.7∶1，相比欧洲白种人（1∶1）偏低。结论：中国CFTR基因M470V多态性改变本身与患者罹患先天性双侧输精管缺如或非梗阻性无精子症无关。M/M、M/V、V/V基因型在中国生育力正常男性人群中的分布符合哈迪-温伯格平衡定律，M470与V470的分布比例约为0.7∶1。 　　【关键词】 CFTR基因； 先天性双侧输精管缺如； 非梗阻性无精子症； 聚合酶链反应； 单核苷酸多态性 　　囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic tibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因M470V多态性（rs=213950）＼[1＼]为CFTR基因外显子10上1540位点上A→G多态导致的氨基酸替换，属于错义突变，其突变等位基因M/V多态性能影响CFTR蛋白氯离子通道活性。不同地区、不同人群中M470和V470的比例不同＼[2＼]，M470V表达情况与个体胰腺功能、肺功能、生育能力等密切相关＼[3，4＼]。国内黄沁等＼[5＼]曾检测我国健康人群中M470V表达情况，为中国CFTR基因相关疾病的研究提供重要的遗传学资料。但在我国生育力正常和不育人群中的M470V分布情况尚不清楚，是否与我国男性不育发生相关也不清楚。因此，本研究利用Cycling probe法检查中国精子发生正常人群与非梗阻性无精子症患者以及先天性双侧输精管缺如患者CFTR基因M470V多态性分布情况，以探讨CFTR基因M470V多态性改变与男性不育之间的关系。 　　1材料与方法 　　1.1标本采集 　　知情同意的情况下收集临床诊断明确的非梗阻性无精子症的男性患者67例、先天性双侧输精管缺如的男性患者95例以及因女方因素拟行试管婴儿助孕、精液常规检查正常的生育力正常男性135例。非梗阻性无精子症病例入选标准：①不育病史；②查体双侧睾丸容积正常或小于正常（小于12ml）；③三次精液常规检查（离心沉淀镜检）均未见精子，排精后尿沉淀亦未见精子（排除逆行射精和不射精），精液pH值正常，精浆果糖及糖苷酶定量分析正常；④生殖激素检测FSH正常或升高（大于12mU/ml），染色体检查正常；⑤睾丸活检病理Johnsen积分法评分介于2～8分之间。以上我院入选病例67例。先天性双侧输精管缺如入选标准：①除原发不育外无其他囊性纤维化疾病症状或表现；②查体双侧睾丸大小发育正常，双侧扪不到输精管；③三次精液常规检查（离心沉淀镜检）均未见精子，排精后尿沉淀亦未见精子（排除逆行射精和不射精），精液pH值呈酸性，精浆果糖及糖苷酶定量分析显著低于正常；④生殖激素检测及染色体均正常；⑤附睾或睾丸穿刺取到精子。生育力正常男性入选标准：①因女方因素拟行试管婴儿助孕；②查体双侧睾丸发育正常；③精液常规检查正常；④染色体检查正常。 　　1.2基因组DNA提取 　　采集外周血2ml，EDTA抗凝。使用DNA抽提试剂盒（EZ1 DNA Blood 200μl Kit， QIAGEN）在BioRobot EZ 1（QIAGEN）全自动核酸提取系统上自动抽提DNA，紫外分光光度计测定DNA浓度，OD值介于1.8～2.0之间留用，否者重新抽提。将提取的DNA编号冷冻保存于﹣80℃冰箱。 　　1.3引物及探针合成 　　参考NCBI prime-blast＼[6＼]，应用软件Primer 5.0自行设计引物，上游引物5′-CTTCTGCTTAGGATGATAATTGG-3′，下游引物5′-GCTTTGATGACGCTTCTGTA-3′，由大连TaKaRa公司合成引物并制作相应的荧光探针应用Cy