标记抗原.ppt

（二）分离方法分类 1. 双抗体沉淀法 2. PEG（聚乙二醇）沉淀法 3. 葡萄球菌A蛋白沉淀法 四、RIA的质量控制 实验室内部质控 实验室间质控 稳定性 精密度 准确度 灵敏度 1、稳定性 ① Bo％要求：30～50 ％（标准抗原为零时标记抗原与抗 体的结合率） ② NSB要求：5～10％（不加特异性抗体时标记抗原与 非特异性物质的结合率） ③ 标准曲线直线回归的参数，a、b稳定，r≈1 ④ ED25、ED50、ED75稳定（标准曲线的结合率在 25%、50%和75%时横坐标上对应的抗原浓度值） 2、精密度：批内CV（变异系数） 5%，批 间5%~10% 3、灵敏度 4、准确度：90%~110% （质控图） 质控图 用于批间质控 将低、中、高质控血清与样品同时测定10批以上，求出各浓度质控血清的均值、标准差，绘制质控图 X 1S 2S 1）三个质控血清中，有一个测定值 3SD 2） － － － ，在同一方向2个2SD 3） － － － ，在同一方向均 1SD 应整批舍弃，重做 五、RIA的基本操作步骤 加样：加入特异抗体Ab和待测样品（待测物Ag或标准抗原Ag）；加入标记抗原* Ag。 温育：给予充分的时间使抗原抗体反应。根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般是37℃。 分离：分离游离标记抗原* Ag和标记抗原抗体复合物* Ag Ab 。 测量：γ计数器分别测量游离 * Ag 或结合 * Ag Ab 的放射性。 数据处理：绘制标准曲线和计算待测物浓度。 免疫放射分析 immunoradiometric assay, IRMA Ag-*Ab + *Ab *Ab + Ag （B） （F） 基本原理 基本原理 免疫放射分析是一种非竞争性的抗原抗体反应，是用过量的放射性标记抗体来测定样品中的抗原，其中标记抗体是过量的，抗原全部是非标记的。 将放射性核素标记在抗体上，然后以过量的*Ab与待测 Ag非竞争性结合，将标记的Ag-*Ab与未结合的标记抗体*Ab分离，通过放射测量来计算出Ag 量。 IRMA的基本方法 根据IRMA的分离方法一般可以分为： 双抗体夹心法（最常用） 标记第三抗体法 生物素－亲和素系统 RIA IRMA 竞争性抗原抗体结合反应 非竞争性抗原抗体结合反应 采用125I标记抗原 采用125I标记抗体 所用抗体是限量的 所用抗体是过量的 * AgAb的量与待测Ag的量呈负相关 Ag * Ab的量与待测Ag的量呈正相关 分析的对象相同：待测抗原物质 但IRMA不适合测小分子半抗原物质，RIA不受限制 IRMA与RIA工作原理的比较 非放射性标记免疫分析技术 酶标记免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术 一、酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。 二、化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。 三、时间分辩荧光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术是利用稀土元素（镧系元素）作为标记物。镧系元素在紫外线的激发下可以持续的发射出一定波长的荧光光子，而其他波长的光子寿命较短，待其他光子衰减后探测特定波长的特异性荧光光子就可以检测复合物的量。 体外放射分析临床应用 肿瘤标志物：AFP、CEA、PSA、CA125、NSE、CA153等 下丘脑-垂体-甲状腺轴类：FT3、FT4、TSH、Tg、TgAb 下丘脑-垂体-肾上腺轴类及肾脏：肾素、血管紧张素等 下丘脑-垂体-性激素类：LH、FSH、PRL、E2 肝脏消化类：ALT、AST、r-GGT等 总 结 放免分析基本原理*** 如何测量未知样品（标准曲线、主要试剂、分离方法、试验步骤）*** IRMA与RIA工作原理的主要区别*** 体 外 分 析 技 术 核医学教研室 赵 红 光 1. 定 义 以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。 放射免疫分析法（Radioimmunoassay）是Yalow和Berson于20世纪50年代在研究胰岛素的时候创立的一种体外放射分析技术。 于1977年获得诺贝尔医学奖 。