目的基因高效表达规律.ppt

基因工程（三） 九、目的基因的高效表达 （一）、基因表达的基础知识 （二）、原核生物基因表达的基本特点 （三）、提高目的基因高效表达的途径 （四）、目的基因高效表达规律 （一）、基因表达的基础知识 1 概念： 1-1 以mRNA为模板的蛋白质合成过程称为翻译或转译 1-2 mRNA： 从DNA到蛋白质的信息传递载体 1-3 遗传密码： 3个碱基编码一个氨基酸，这三个碱基被称为三联体密码或密码子 2 核糖体：合成蛋白质的“工厂” 核糖体由两个亚基构成，一个较大，一个较小 原核生物 3.蛋白质的合成机理（以原核生物为例） 肽链延伸的方向：N末端—C末端 mRNA的翻译方向：5’——3’方向 tRNA识别密码子，并转运氨基酸 合成的起始：大肠杆菌中被翻译的第一个密码子往往是5’端的第25个核苷酸以后，起始密码子：AUG，偶有GUG，在上游约10个bp的地方往往有一段富含嘌呤的序列（SD序列），它与16SrRNA3’端互补。 合成的步骤：新进入的酰胺-tRNA结合到核糖体上——肽链的形成——移位 合成的终止：识别终止信号： UAG，UAA，UGA 4 多肽合成后的定向加工与转译后加工 4-1 信号肽：在真核生物中，当某一种多肽的N－末端刚开始合成不久，这种多肽的取向就被决定，这是因为受这个N末端的信号肽的控制。 在细菌中，也存在类似情况，新生肽的N－末端也有一段信号肽结构，有时也叫引导肽 4-2 多肽的修饰： N末端信号肽的切除 二硫键的形成 线性多肽呈现出一定空间结构 多肽链的糖基化等 （二）、原核生物基因表达的特点 原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 原核生物的表达是以操纵子为单位的。 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的 ④ 原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 ⑤ 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。 ⑥ 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。 （三）、提高目的基因高效表达的途径 一个含有目的基因的受体细菌能否高效表达，将取决于基因的结构特征、宿主菌、载体构建和细胞培养等多个方面。对于原核生物的细菌等受体来说，提高目的基因表达效率主要从以下几个方面考虑： 目的基因转录和翻译方面 目的产物本身 宿主菌改造方面 宿主菌培养方面 1、目的基因转录和翻译方面 1-1启动子对表达效率的影响 影响外源DNA转录的主要因素是启动子的强弱。 启动子是宿主细胞的RNA聚合酶转移结合并起始转录的合成mRNA的部位。大多数外源的特别是真核细胞的启动子不能被细菌（大肠杆菌）RNA聚合酶识别，因此必须将外源基因置于大肠杆菌启动子控制下。 启动子的强弱必须适合，太强不利于宿主菌的正常生长代谢，太弱则目的基因转录太少，不利于目的产物的表达。 1-2 转译起始序列对翻译水平的影响 翻译水平的影响外源基因的表达的重要因素是翻译起始区。翻译是在核糖体上进行，SD序列对翻译是必须，而且它也能影响到翻译的效率。 1-3 充分考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中、弱密码子。 2 目的产物方面 2-1 目的基因不溶性的高效表达 过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。 举例：胰岛素与β-半乳糖苷酶形成包涵体 优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。 缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的 适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物 2-2目的基因的高效可溶性表达 概念：不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为非融合蛋白。 这种蛋白质或者能够抵抗蛋白酶的水解，或者是在蛋白酶缺失的条件下生成。 优点： 无需经过融合蛋白阶段，表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。 缺点：容易被细菌蛋白酶所破坏。 适合：需要蛋白酶缺陷菌作为宿主菌或这改变启动子强度、或者改变宿主菌的培养条件。 举例：大肠杆菌蛋白酶的合成主要依赖次黄嘌呤核苷(lon)，因此采用lon-缺陷型菌株作受体菌，则使大肠杆菌蛋白酶合成受阻，从而使目的基因的表达产物得到保护 2-3目的基因的高效分泌表达 概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外 优点：① 防止宿主菌对表达产物的降解