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应用富含血小板血浆构建组织工程骨的研究 　　[摘要] 目的 探究富含血小板血浆（PRP）是否能成为接种骨髓间充质干细胞（BMSCs）于3D支架中的有效媒介，是否具有促进骨组织再生、新生骨成熟及血管化的作用，为组织工程骨的构建策略及动物实验和临床应用提供理论依据。 方法 体外培养新西兰兔BMSCs至第三代作为种子细胞，分别应用PRP组、乏血小板血浆（PPP组）重悬BMSCs，双相接种法构建细胞/支架复合体，另设对照组，通过检测支架内DNA含量、碱性磷酸酶（ALP）含量，对比细胞的接种效率、增殖和分化情况。 结果 PRP 组的成骨量较PPP组和对照组显著（P0.05）。 结论 用PRP介导的双相接种法可以促进BMSCs在细胞/支架复合物中增殖并向成骨分化；PRP双相接种法是一种可行的构建组织工程骨的方法，具有很大的潜力和广阔的应用前景。 　　[关键词] 组织工程骨；骨髓间充质干细胞；富含血小板血浆；3D-PLGA支架 　　[中图分类号] R62 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（b）-0020-05 　　骨组织工程的核心在于“仿生”，即构建适合成骨的内环境，模拟自然成骨机制，实现骨移植物与宿主组织的生物学相容，在成骨的同时组织工程支架材料逐步降解成无毒害代谢物，移植物复合体最终被新生骨组织替代。理想的组织工程骨应具有强大的骨诱导和血管生成潜能、生物学安全、低并发症、构建程序简便、使用寿命长等特征[1-2]。目前的移植物尚未完全达到上述标准。学者们在构建组织工程骨的尝试中，逐渐认识到细胞和生物活性因子的复合构建比单纯细胞或生物活性因子的构建成骨效果要好[3]。在成骨系细胞的体外培养实验中，骨形态发生蛋白家族（Bmp）、血小板源生长因子（PDGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）是已被证实的具有促进细胞增殖和诱导成骨作用的细胞因子[4-7]。 　　富含血小板血浆（platelets-rich plasma，PRP）是将全血离心后得到的血小板浓缩物，浓度通常为全血的4～6倍，其被凝血酶激活后，可以释放大量生长因子，如PDGF、TGF、VEGF、表皮生成长因子（EGF）、BMP等[8]。因此，以PRP为媒介复合种子细胞构建组织工程骨理论上有如下优势：PRP源自宿主自体血浆，生物相容性好，不会产生免疫排斥反应；PRP在凝血酶激活下不仅可释放大量生物活性因子，凝血反应所引发的由液-固态转变过程有利于细胞黏附在支架上，提高种子细胞的接种效率[9]； PRP所含成分和血浆相似，在一定程度上模拟了细胞增殖分化的微环境[10]；提取PRP和添加凝血酶的过程较简单，实际应用上操作可行。 　　兔骨髓间充质干细胞（MSCs）是理想的种子细胞。其有可以较容易地提取、具有强大的体外扩增能力和分化潜能、免疫排斥反应轻微等优点[11]。为了探究PRP能否在组织工程骨支架材料上促进种子细胞的黏附、增殖、分化，本研究以MSCs为种子细胞设计了2个实验组，PRP组（MSCs+PRP+支架）和PPP组（MSCs+PPP+支架），另设一个空白对照组（MSCs+支架），比较MSCs的增殖和分化情况。 　　1 资料与方法 　　1.1 实验动物 　　新西兰白兔1只，2 月龄，体重2.0～2.5 kg，雄性，来源于山西医科大学实验动物中心，动物等级为清洁型。 　　1.2 主要实验试剂 　　DMEM培养基（Low Glucose，Gibco）、胎牛血清（Hyclone）、β-甘油磷酸钠（10 mmol/L，Sigma）、L-抗坏血酸（50 μg/ml，Sigma）、地塞米松（10-8 mol/L，Sigma）、胰蛋白酶（0.25%，Sigma）、L-谷氨酰胺（Sigma）、青霉素-链霉素（100 U/ml）、TGF-β1（10 μg/L，Sigma）、吲哚美辛（50 μmol/L，Sigma）、IBMX（0.5 mmol/L，Sigma）、牛胰岛素（10 mg/L，来宝生物公司）、PBS缓冲液。淋巴细胞分离液（Percoll，Sigma）、0.25%胰酶（Sigma）、枸橼酸葡萄糖抗凝剂ACD（0.48 g枸橼酸、1.32 g枸橼酸钠、1.47 g葡萄糖）、3D-PLGA支架、凝血酶溶液（10 000 U凝血酶，Sigma）、10%CaCl2（Sigma）、骨细胞消化液、小牛胸腺DNA标准液、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、0.1%茜素红-Tris-HCl染液、1%甲苯胺蓝染液、油红染液。 　　1.3 实验仪器 　　超净工作台，高速低温离心机，孵箱，倒置相差显微镜，超声细胞破碎机，荧光酶标仪。 　　1.4 MSCs原代培养及传代 　　于一只新西兰白兔无菌环境下用骨穿针