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自身γδT细胞治疗乙型肝炎的临床观察 　　[摘要] 目的 观察γδT细胞和HepG212115细胞共培养后对其HBV复制和HBeAg表达的影响。评估用γδT细胞过继回输治疗乙型肝炎的疗效。 方法 在体外用异戊希焦磷酸法和IL-2激活人外周血PBMCs，细胞经10 d培养后用流式细胞术检测培养前后γδT细胞含量和Perforin、GranB、NKG2D表达量；将γδT细胞与HepG212115细胞按一定比例共孵育培养后，ELISA法测定上清中HBeAg的表达。将培养10 d的γδT细胞回输给患者；患者一个疗程接受γδT细胞总数在0.8×1010～7.0×1010。 结果 培养10 d时γδT细胞数为91.27%，其细胞表达的Perforin、GranB、NKG2D分别为和62.8%、72.7%和60.8%。所扩增的γδT细胞能够部分抑制HepG212115细胞中HBeAg的表达。治疗前138例HBeAg阳性者，治疗后有76例HBeAg（55.1%）转阴。总有效率为77.51%。 结论 γδT细胞能够降低HepG212115细胞中HBeAg表达；用自身γδT细胞过继回输治疗乙型肝炎后患者的HBeAg+HBV- DNA 转阴率达74%。该治疗无毒副作用，对乙型肝炎是一种安全有效的治疗方法。 　　[关键词] 异戊烯焦磷酸单酯；乙型肝炎；γδT细胞；HepG212115细胞；免疫治疗 　　[中图分类号] R512.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0027-04 　　目前抗乙型肝炎病毒的治疗一般采用核苷类似物或/和IFN–α联合治疗，虽然具有一定的临床疗效，但均难以彻底清除病毒。随着对抗病毒细胞免疫学与分子生物学的深入研究和对乙型肝炎发病机理的研究阐明，细胞免疫治疗正在成为乙型肝炎治疗的一种重要手段。γδT细胞是一种较新型的肿瘤效应细胞，国内外许多研究证实，人外周血中培养的γδΤ细胞具有较强的抗肿瘤效应，但目前对其应用于慢性乙型肝炎临床治疗的报道较少。Poccia等[1]报道，γδT细胞在早期的抗病毒免疫应答过程中发挥重要的作用。由于γδT细胞仅占外周血淋巴细胞总数的1%～5%，限制了其临床应用研究。本研究应用患者自身外周血单个核细胞（PBMC）在体外用异戊希焦磷酸法刺激PBMCs来特异性扩增γδT细胞，然后将培养成功的细胞回输给乙型肝炎病毒（HBV）感染患者，通过近期和中长期的随访来观察治疗效果。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 　　1.1.1 研究对象 按1995年全国病毒性肝炎诊断标准，选择160例在第九七医院于2005年1月～2012年6月住院与门诊病人，其中慢性乙型肝炎89例，乙型肝炎病毒携带者71例。女64例，男96例，年龄18～59岁。160例中138例HBV-DNA和HBeAg均阳性，22例仅为 HBV-DNA阳性；所有患者1年内均未行抗病毒治疗。治疗之前均明确告知本治疗的优点和不足，患者或家属签署知情者同意书，并报医院伦理委员会批准。 　　1.1.2 试剂 rhIL-2（比活性40 U/ng）（Promega公司）；RPMI1640、胎牛血清（Gibico公司）；淋巴细胞分离（Ficoll，1.077）（上海第二制药厂）；HBeAg酶免检测试剂盒（山东3V）；乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）。荧光标记的单抗和同型对照抗体FITC-mIgGI、PE-mIgF2a（DB公司和PHarmingen公司）；FITC标记的Anti-TCR-γδ、PE标记的穿孔素（Perforin）、颗粒酶B（GranB）、NKG2D及FixPerm破膜剂（购自ebioscience公司）；IPP（Sigma公司）。HepG212115细胞购于上海细胞所本室传代保存。流式细胞仪（美国B.D公司的FACSCaliar，分析软件为ELITE），Rochelightcycler荧光PCR检测仪（瑞士罗氏公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 γδT细胞的培养和鉴定 用Baxter CS-3000血细胞分离机分离患者PBMC，采集血液总量4 000～5 000 mL，获取的PBMC（含有部分红细胞）数为2.0×109～4.5×109，在进行PBMC采集时留取100 mL自身血浆在细胞回输时应用。将采集的PBMC分离出部分血浆应用于自身细胞培养，其他细胞悬液用淋巴细胞分离液分离，以1500 r/min离心10 min、离心半径15 cm，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3次（1500 r/min离心，10 min/次、离心半径15 cm），将细胞用无血清培养基配成1×109/L的细胞悬液（含3%人自身血清、IL-2 1×105 U/L和