突变体质粒构建—PCR法-2012.docVIP

实验题目：突变体质粒构建——PCR法 背景与原理： 蛋白与蛋白间，蛋白与核酸间相互作用是后基因组学研究重要内容之一，而体外突变技术则是研究这种复杂关系的一个有效手段。通过PCR方法可向目的DNA片段中引入任何所需的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。PCR定点突变迅速、高效并且重复性好，是基因研究工作中一种非常有用的手段。其基本原理可简述如下图： 本实验拟在某基因编码区（CDS）内，通过PCR定点突变引入一个EcoRI酶切位点。该基因片段长724bp，上下游分别以XhoI和BamHI两个酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1，即pcDNA3.1-CDS。此基因内部含有一个EcoRI酶切位点，我们通过PCR法诱变又形成一个EcoRI酶切位点，可以通过EcoRI单酶切验证突变是否成功。具体设计如下： 仪器、试剂及药品配方： 仪器：PCR仪，电泳槽，水浴锅，凝胶成像仪，离心机，振荡培养箱，温箱，超净工作台，冰箱 试剂及配方： 试剂：DNA回收试剂盒，限制性内切酶（BamHI，EcoRI，XhoI），T4连接酶，DNA电泳marker PCR反应体系： primex 12.5μl 模板 1μl 上游引物（μM） 2μl 下游引物（μM） 2μl 水 7.5μl primex配制： primex Taq酶 0.125μl 10×Taq酶buffer 2.5μl dNTP（2.5μM） 2μl 水 7.875μl DNA电泳buffer（TAE）： 工作液（1×） 储存液（50×） 40mM Tris-乙酸 242g Tris/57.1ml冰乙酸 1 mM EDTA 100ml 0.5M EDTA（pH8.0） LB液体培养基（1000ml） 蛋白胨 10g 酵母抽提物 5g NaCl 5g LB固体培养基（100ml） 蛋白胨 1g 酵母抽提物 0.5g NaCl 0.5g 琼脂粉 1g 实验方法： PCR制备突变体片段： 3.1.1第一轮PCR反应体系： 反应Iμl体系) 反应IIμl体系) primex 125μl primex 125μl 模板 1μl 模板 1μl 引物1（μM） 2μl 引物3（μM） 2μl 引物2（μM） 2μl 引物4（μM） 2μl 水 水 7 反应条件： 94℃ 1min 94℃ 30S 30循环 55℃ min 72℃ 30S 72℃ 5min 3.1.2 第二轮PCR反应体系：μl 体系) primex 25μl 产物I 2～3μl 产物II 2～3μl 引物1（μM） 2μl 引物4（μM） 2μl 水 补足至μl 注：引物1/引物4在PCR反应进行8个循环后加入。 反应条件： 94℃ 1min 94℃ 30S 35循环（第8个循环后暂停加入引物） 55℃ 1min 72℃ S 72℃ 5min 凝胶回收： 配制琼脂糖凝胶； DNA琼脂糖凝胶电泳； 紫外灯下截取相应的DNA片段凝胶，置于1.5ml dorf 管内； 每管加入500μl 溶液A，55℃水浴融化10min； 每管加入15μl 溶液B，； 离心12000rpm，30s； 弃下管液，每管加入500μl 溶液C，离心12000rpm，30s； 重复步骤g（弃下管液，每管加入500μl 溶液C，离心12000rpm，30s） 弃下管液，离心12000rpm，30s； 新管，每管加入25μl 溶液D，室温放置2min； 离心12000rpm，1min。 酶切体系： 3.3.1构建质粒酶切体系： 酶切片段 酶切载体 片段 10μl pcDNA3.1 10μl BamHI 1.5μl BamHI 2.5μl XhoI 1.5μl XhoI 2.5μl 10×K 6μl 10×K 6μl 水 41μl 水 39μl 3.3.2酶切验证体系： 酶切体系I 酶切体系II 质粒 μl 质粒 μl BamHI 0.5μl EcoRI 0.5μl XhoI 0.5μl 10×K 1μl 10×H 1μl 水 补足至10μl 水 补足至10μl 3.4 连接体系： 载体（100ng） μl 片段（68ng） μl T4连接酶 0.5μl 10×buffer 1μl 水 补足至10μl 制备感受态： 取培养的菌液1ml转至100ml LB液体培养基，菌体振荡培养至OD600＝0.35（可凭经验）； 将100ml菌液转至两个冰预冷的灭过菌的50ml离心管内，冰浴10ml； 离心，4℃ 4000rpm，10min； 弃上清，每