酶的化学修饰 前理论后例子.pptVIP

1 1、概念 凡通过化学基团的引入或除去而使蛋白质（酶）共价结构发生改变，从而改变蛋白质（酶）的某些特性和功能的过程都可称蛋白质（酶）的化学修饰。 2、酶的化学修饰的目的和意义 ①目的： 　　构象优化、结构稳固 1． 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。 2． 作用的最适条件不符。 3． 酶的主要动力学性质的不适应。 4． 临床应用的特殊要求。 ②意义： 　A.天然酶的活性维持存在缺陷；（如：异体蛋白的抗原性、易受蛋白酶水解、抑制剂抑制、活性半衰期短） B.天然酶的使用性能存在缺陷；（如：酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热失活能力差，容易受产物抑制） C.天然酶的应用存在潜力。（如：通过酶的分子改造可提高酶的稳定性、解除酶的抗原性、改变酶学性质(最适pH、最适温度、Km值、催化活性和专一性等)、扩大酶的应用范围） 三． 酶化学修饰的基本原理 1． 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 2． 如何保护酶活性部位与抗抑制剂 3． 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 4． 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 （1）酶分子的表面修饰： 1）化学固定：酶与惰性载体共价固定（即共价固定化酶）； 2）小分子修饰：用化学小分子修饰酶的表面基团；（如：对酶分子的侧链基团，尤其酶活性中心的必需基团进行化学修饰） 3）大分子修饰 非共价修饰:与大分子物质非共价结合，增加酶的稳定性; 共价修饰:用可溶性大分子共价连接于酶分子表面，形成覆盖层. 4）分子内交联：增加酶分子表面基团相互交联，稳定酶分子； 5）分子间交联：用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶 6）脂质体包埋：固定化修饰之一，可改善稳定性和免疫性； 7）反相胶团微囊化：在非极性有机溶剂中加表面活性剂与酶形成含水分子的反相胶团，酶分配在团内的水性环境中，使酶与有机相分开，避免酶变性。 1）非催化活性基团的修饰：如金属离子置换修饰，可改变酶动力学性质和酶亲和能力； 2）酶蛋白主链修饰：有限水解修饰； 3）催化活性基团修饰：选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代，即化学突变法； 4）肽链伸展后的修饰：为了有效处理酶分子内部区域，先用脲、盐酸胍处理酶，使酶链充分伸展，修饰后再折叠成具有某种活性的构象； ①酶蛋白质功能基团的可反应性； ②修饰剂的可反应性。 1、基团定位因素 蛋白质多数非极性侧链(疏水侧链)位于非常致密的分子基体的中心，而多数极性带电侧链(亲水侧链)位于基体的表面。蛋白质分子的表面特点影响化学试剂的接近。 2、蛋白质局部微区性质的影响 功能基的反应性是通过它的亲核性来显示的，而亲核性又常常与它的酸碱性有关，即与基团的pK有影响。 微区的极性是决定基团解离状态的关键因素之一。 如：乙酸在水中的pK为4．76，在80％乙醇中增至6．87，在100％乙醇中增至10．32。乙酸羧基所处微区的极性直接与介质的介电常数有关。随介质极性降低，羧基的pK升高。 卵清溶菌酶中第35号谷氨酸的-C00H在25℃时的pK为5.9，而当溶菌酶与其抑制剂三-N-乙酰氨基葡萄糖结合后，此pK则升至6.4。 pK的提高可能是由于这个残基的微区极性降低之故。 天然蛋白质通过氢键来维持其稳定性，也是使pK发生改变的一个因素。 例如，2-氟酚的pK比2-溴酚的pK高0.7。这是由于氟与酚基形成氢键的能力比溴强。 水杨酸的羧基可与其酚基形成O--H…O氢键，结果使其羧基的pK比正常值小1，同时使酚基的正常pKl0改变到pKl3。 不同蛋白质中的组氨酸残基的pK是不同的。 碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4个组氨酸残基。碳酸酐酶的pK是：5.91；6.04；7.00；7.23；葡萄球菌核酸酶的pK是：5.37；5.71；5.74；6．50。组氨酸残基在这两个蛋白质中的pK范围是5．37～7．23，pH几乎相差2。这些变化可能是由于带电基团相互影响所致。 处于蛋白质表面的功能基比较容易与修饰剂反应。如果烷基在空间上紧靠功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时就要出现位阻效应。 如：对枯草杆菌蛋白酶BKN的所有的10个酪氨酸残基均在蛋白质分子表面，而且其结构上的苯酚的羟基几乎在所有情况下都没有形成氢键。但是，如果对它进行彻底硝化和碘化后，10个酪氨酸中只有8个被修饰。 超反应性指的是蛋白质的某个侧链基团与个别试剂能发生非常迅速反应的能力。 蛋白质中的功能基与简单氨基酸中的相同基团相比，反应性要差。 但是,每个蛋白质分子中至少有一个基团对一定的试剂显示出超反应性。超反应基团不一定是酶活性部位上的基团。 ①改变蛋白质功能基团的pK值； ②蛋白质功能基团具有较大的亲核性； ③通过静电相互作用吸引试剂，并使其有适当取向； ④试剂与靠近修饰部位的蛋白质区域之间的立体化学适应性； 超反应性由一个或几个因素的综