PCR问题汇总PCR问题汇总.doc

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PCR问题汇总PCR问题汇总

如何防止PCR形成引物二聚体?   在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,对照marker时都不容易看出其大小,具体是什么原因呢?PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适?   答:1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了,形成引物二聚体的原因很多,如引物设计的不好,在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对;退火温度没有达到最佳,实在不行就做个温度梯度吧;再就是试着改变一下循环数,也许会有帮助。      PCR模板大约在104-106个拷贝。   答2:我觉得是目的条带含量太多了,如果点样太多,负载量太大,就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量,稀释10倍或是减少循环数。   答3:1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法;   2. 可能模板有问题;PCR后的电泳带形成很宽很亮的带,可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致;   3. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;   4. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的;   5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性;   6. PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加TAq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。   7. 增加循环数可以适当降低引物二聚体;   8. 降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些);   9. 若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。   10. 以上次的pcr产物作模板二次pcr,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍。 PCR假阴性的原因分析   PCR的假阳性问题是在PCR诞生之初就被深刻认识到了,同时由于造成假阳性的因素相对单一,因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。如果一个项目只是阳性率高敏感性好的话,那么可以认为其阴性结果具备很高的可排除性,仍然有相当的临床适用价值。但PCR的假阴性在检验工作中仍很严重,并且用些因素经常被人忽略,严重的影响了PCR的使用。可以想象一种假阳性和假阴性都很高的项目,有什么样的诊断价值。        造成PCR假阴性的原因是复杂的,也是多样的。主要有:        1.PCR仪本身的质量问题。PCR仪设计原理上的差异和经常出现的质量问题(如:温控不准等)给临床带来了诸如非特异性扩增(假阳性)、扩增效率下降(假阴性)等问题.        2.离心机问题。离心机的质量或使用不正确,造成离心标本模板没有分离出来造成假阴性,窃以为这是最易被忽视的问题。其时离心机使用问题不仅在PCR,在整个检验工作中都是最易被忽视的问题,只是因为在其他工作中不象PCR那样明显影响检测结果罢了。        离心机是常用的固液分离设备,其利用离心过程中的离心力而将密度不同的物质分离出来。因此离心机的关键在于离心加速度而不是转速,根据牛顿定律可知离心力加速度与转速和有效半径的有关的,因此对于不同有效半径的离心机相同的转速其离心加速度是不同的,转速的调节要因离心机而异,但很遗憾,日常工作中忽视了这个问题。有效半径短的离心加速度就小,同样的时间离心效果就差可能造成分离不出导致假阴性。同时由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热,因此对于称能上几万转/分而没有抽真空的离心机实际转速本人持怀疑态度。        3.试剂开壳剂和操作问题造成标本DNA没有暴露出来,致使扩增无法进行,这是造成假阴性的又一主要因素。 问题1:无扩增产物   现象:正对照有条带,而样品则无   原因:   1.模板:含有抑制物,含量低   2.Buffer对样品不合适   3.引物设计不当或者发生降解   4.反应条件:退火温度太高,延伸时间太短   对策:   1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量   2.更换Buffer或调整浓度   3.重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物   4.降低退火温度、延长延伸时间            问题2:非特异性扩增      现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带   原因:   1.引物特异性差   2.模板或引物浓度过高   3.酶量过多   4.Mg2+浓度偏高   5.退

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