分子生物学基础知识.doc

前 言 中心法则： 第一章 PCR 一、概念： PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。 二、原理： DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、引物 PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计的基本原则 ①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右，Tm值在60℃比较好。 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。 常用引物设计软件有：Primer Premier5.0 、Vector NTI Suit、DNAstar等 Tm值： Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。 Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 四、示意过程： 例如：Taq Plus DNA Polymerase(P201) 反应体系： DDW To 20μl Taq DNA Polymerase (5 U/μl) 1U-2U 10 × Taq Plus Buffer(with 15mM MgCl2) 2μl 25mM MgCl2 optional dNTP Mix (10 mM each) 0.4μl 引物F (10 μM) 0.8μl 引物R (10 μM) 0.8μl 模板DNA 根据说明书提供的参考浓度选择 反应程序： 95℃ 5 min (预变性) 95℃ 30 sec 30-35循环 60℃ 30 sec 72℃ 60 sec/kb 72℃ 7 min (彻底延伸) 附：DNA与RNA的区别？ 1、组成单位不同：DNA的组成单位是脱氧核苷酸，RNA的组成单位是核糖核苷酸， 2、组成碱基不同：DNA的组成碱基是ATGC，RNA的组成碱基是AUGC 3、组成五碳糖不同：DNA的组成五碳糖是脱氧核糖，RNA的组成五碳糖是核糖， 4、空间结构不同：DNA是双螺旋结构，RNA一般是单链。 5、功能不同：DNA是遗传物质，RNA一般在细胞中不作为遗传物质。 第二章 逆转录 一、概念： 逆转录(reverse transcription)是以RNA为模板合成DNA的过程。以DNA为模板合成RNA的过程叫做转录，此过程与该流动方向（DNA到RNA）相反，故称为逆转录。 二、原理： 人们通过体外模拟该过程，以样本中提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成出互补的cDNA，构建cDNA文库，并从中筛选特异的目的基因。该方法已成为基因工程技术中最常用的获得目的基因的策略之一。 三、mRNA： Messenger RNA (mRNA）——又叫做信使RNA，是一类在蛋白质合成时充当模板的RNA。信使RNA是脱氧核糖核酸（DNA）转录合成的带有遗传信