分子生物学实验.doc

3、限制酶可分为?Ⅰ、Ⅱ?、Ⅲ??型三大类。???????????? 4、影响核酸限制性内切酶的活性的因素是①DNA?的纯度；②DNA?的甲基化程度；??????????????③酶切消化反应的温度；④DNA的分子结构；⑤溶液中离子浓度及种类；⑥缓冲液pH值。? 5、琼脂糖溶化再凝固后能形成带具有一定形状、大小与孔隙度的固体基质?(密度与琼脂糖浓度相关)，可以起到?分子筛?的作用；? 6、等长度的单链DNA和双链DNA在中性或碱性凝胶中的迁移率?大致相等?。? 7、影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：?①??DNA的分子大小；??②?琼脂糖浓度；?③DNA?构象；④电场强度；⑤碱基组成与温度；⑥嵌入染料的存在；⑦电泳缓冲液的组成 8、EB是??溴化乙锭?。 11、EDTA的作用是??螯合二价阳离子以抑制DNase???。? 12、PCR反应分为??变性?、退火??和??延伸?三步。?? 13、去垢剂（如SDS）的作用是?溶解细胞膜并使蛋白质变性?。? 14、DNA的浓度和纯度鉴定：OD260/OD280=?1.8-2.0?；?1OD260=?50?μg/?ml?15、制胶时，胶的厚度不超过?0.5cm?。? 实验一??DNA的制备? （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？? 溴化乙锭（Ethidium?bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌)?? （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？? 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。?? （3）DNA电泳时所用的琼脂糖凝胶其浓度是如何决定的？ ?1．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系?? （2）琼脂脂糖的浓度?不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。??琼脂糖浓度与DNA分离范围?? 琼脂糖浓度?/%?0.3?0.6?0.7?0.9?1.2?1.5?2.0?? 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1? （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么? DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大 小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。??? （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？? 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。? （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？? CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来?氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。? 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。?75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁?? 实验二??RNA的制备? 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？? 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入;? 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。?? 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ ?研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。?质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因? 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？? 1.2%琼脂糖凝胶电泳。在紫外检测仪下观察，完整的总RNA样品应呈现三条带：28S、18S、和5S?rRNA。其中28S?rRNA条带的亮度应该为18SrRNA条带的1.5~2倍。反之，说明部分28S?rRNA已经降解成18S?rRNA。若无清