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分子生物学技术总结 姓名：梁潇 班级：2班 学号：1080800066 一、核酸/蛋白分离技术 1．DNA分离：破碎细胞→抽提蛋白质→DNA沉淀→乙醇洗除盐→琼脂糖凝胶电泳检测 用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA是上解离下来，经苯酚、氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE缓冲液中即得到相对分子量高的DNA。 2．RNA分离：抑制RNase→抽提去蛋白质→DNase消化DNA→甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 3．蛋白分离： 离子交换层析 （1）层析法 亲和层析 （2）电泳分离：聚丙烯酰胺凝胶电泳　 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 应用：分离蛋白质和寡糖核苷酸 二、基因克隆技术 1．PCR：在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促和反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1）变性（92~95℃） 2）退火 3）延伸 PCR各步骤的目的 （1）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。 使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 （2）变性--退火--延伸循环：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； 　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 （3）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟：用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：①延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）②根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量 ③继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。 基因组PCR（无内含子基因） PCR RT-PCR（含有内含子的基因） RACE/Gene Walking（从部分基因获得全长基因） SMARTTM 3’-RACE：利用mRNA的3 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3 末端的DNA片段扩增出来。 SMARTTM 5-RACE：先利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5 末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图）。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，