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DNA凝胶电泳常用试剂配制.
DNA的凝胶电泳
1.琼脂糖凝胶电泳
含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围
凝胶中的琼脂糖含量〔%(w/v)〕 线状DNA分子的有效分离范围(kb) 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2
常用电泳缓冲液
缓冲液 使用液 浓储存液(每升) Tris-乙酸(TAE) 1×:0.04mol/L Tris-乙酸
0.001mol/L EDTA 50×:242g Tris碱
57.1ml冰乙酸
100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸(TPE) 1×:0.09mol/L Tris-磷酸
0.002mol/L EDTA 10×:108g Tris碱
15.5ml 85%磷酸(1.679g/ml)
40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸(TBE)a 0.5×:0.045 mol/L Tris-硼酸
0.001mol/L EDTA 5×:54g Tris碱
27.5g硼酸
20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液b 1×:50mmol/L NaOH
1mmol/L EDTA 1×:5ml 10mol/L NaOH
2ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) a.TBE浓溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液,出现沉淀后则予以废弃。
以往都以1×TBE作为使用液(即1:5稀释浓贮存液)进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1:10稀释的贮存液作为使用液。
进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的1×TBE,是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的2倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小,故通过缓冲液的电流通量通常较大,需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。
b. 碱性电泳缓冲液应现用现配。
凝胶加样缓冲液
缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 Ⅰ 0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
40%(w/v)蔗糖水溶液 4℃ Ⅱ 0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
15%聚蔗糖(Ficoll)(400型;Pharmacia)水溶液 室温 Ⅲ 0.25%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF
30%甘油水溶液 4℃ Ⅳ 0.25%溴酚蓝
40%(w/v)蔗糖水溶液 4℃ Ⅴ 碱性加样缓冲液
300mmol/L NaOH
6mmol/L EDTA
18%聚蔗糖(Ficoll)(400型;Pharmacia)水溶液
0.15%溴甲酚绿
0.25%二甲苯青FF 4℃ 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品浓度,以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,从而使加样操作更为便利;含有在电场中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中泳动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBE作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5-1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是,对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱性pH条件下其显色较溴酚蓝更为鲜明。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳
DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围
丙烯酰胺〔%(w/v)〕a 有效分离范围(bp) 二甲苯青FFb 溴酚蓝b 3.5 1000-2000 460 100 5.0 80-500 260 65 8.0 60-400 160 45 12.0 40-200 70 20 15.0 25-150 60 15 20.0 6-100 45 12 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺占丙烯酰胺浓度的1/3.
给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片断的粗略大小(核苷酸对)
30%丙烯酰胺:
丙烯酰胺 29g
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 1g
加水至100ml
将溶液加热至37℃使化学药品溶解
小心:丙烯酰胺是强烈的神经毒素,可经皮肤吸收。丙烯酰胺的作用具有累积性。称取粉末状丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺时必须带手套和面具。取用含上述化学药品的溶液也要戴手套。尽管可以认为聚丙烯酰胺无毒,但鉴于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺,故仍应小心处理。
10%过硫酸铵
过硫酸铵 1g
加水至10ml
可在4℃保存数周。
制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积(总体积100ml)
试剂 制备不同浓度(%)凝胶所用试剂的毫升数 3
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