原位杂交2014重点.ppt

双链DNA探针和靶DNA变性 微波高火状态煮30 分钟，自然冷却2-3 分钟。 非放射性标记系统主要包括三大类：半抗原类、荧光色素类、酶类。其中半抗原类使用最为广泛，商品化选择最多。 半抗原类主要有生物素(biotin)、地高辛、二硝基苯(dinitrophenyl)、雌二醇等，前两者使用最为广泛，且均有商品化试剂盒选用。 半抗原 　　hapten 　　能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。 1.生物素系统工作原理是 将生物素化的( d )UTP掺人探针后，加人酶(AP/HRP)联亲和素(avidin/streptavidin)，利用生物素与亲和素之间存在特异亲和力使亲和素与探针结台；而后加入该酶的显色或发光底物显示结果.然而,生物素系统存在一个较大的缺陷，即生物素是一种维生素分子，它普遍存在于各种细胞中,因而在原位杂交时内源性背景大。 地高辛是一种类固醇半抗原化合物，化学名为异羟基洋地黄毒甙，来源于植物毛花洋地黄。自1988年由德国宝灵曼将其开发为非放标记系统。与生物素相比较，它不存在于一般生物体中，因而消除了内源性背景的问题。并且有报导表明，在原位杂交中，地高辛系统标记效率更高，达到每20碱基带有一个地高辛配基，且杂交后又有灵敏的酶免疫检测体系，因而其灵敏度在原位(膜)杂交中10倍于生物素系统。地高辛现已成为使用最广的非放射性标记物，尤其在原位杂交中已基本取代生物素系统，是迄今为止较为完善的一种非放射性标记系统。 2. 荧光色素类 荧光色素类主要包括荧光素、异硫氰酸荧光素、香豆素、德州红等。其工作原理(以荧光素为例)是通过酶促合成将荧光素化的( d )NTP掺人到探针分子中，杂交后直接在荧光显微锛下观察结果。该法简单快捷，但没有放大过程，灵敏度较低，仅适用于检测高拷贝序列；而且荧光强度随着激发光照射时间的增加而衰退。 利用不同荧光色素在激发光下可发出不同颜色的荧光的特征，不同颜色荧光色素标记探针的使用可进行多重原位杂交以同时检测多个基因的表达情况。 荧光探针多用于染色体、培养细胞或冰冻切片标本. 荧光色素既可用于荧光标记，又可作为半抗原标记。用作后者时，其原理与地高辛系统类似，只需将酶联地高辛抗体换为荧光色素抗体即可。此时，其灵敏度高于前者的直接检测法；同时也为多重标记检测增加了一种标记途径. 3. 酶标法 以Amersham Pharmacia公司开发的ECL系统为代表。它是在戊二醛的作用下将辣跟过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)与寡棱苷酸探针片断直接共价相连，此法简化了检测步骤，减少了非特异污染的可能。有研究表明，其灵敏度甚至超过了多重半抗原标记的探针。但酶标法有一个缺点，由于酶是具有生物活性的蛋白质分子，易变性。因而，从标记到杂交以及其后的洗脱整个过程不能采用剧烈的条件：温度不超过42℃，不能使用强酸、强碱及去污剂，离子强度要适中。而以上条件正是除去非特异性杂交的有效手段，因而选择直接酶联法要注意其非特异性背景的问题。 非放射性标记物发展方向为灵敏度高、稳定性好、实验周期短、检测方法简单、安全。 在这些系统中以新的荧光色素类标记物最具潜力。潜力股 光促生物素标记核酸技术: 在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度 血清肌钙蛋白ADRA1 人类基因定位的基本方法 1. 2. 3. Clinical Chemistry 52: 319-322, 2006; Use of RNA Fluorescence In Situ Hybridization in the Prenatal Molecular Diagnosis of Myotonic Dystrophy Type I Emanuela Bonifazi1,a, Francesca Gullotta1, Laura Vallo1, Raniero Iraci1, Anna Maria Nardone2, Ercole Brunetti3, Annalisa Botta1 and Giuseppe Novelli1,2  1 Chairs of Human Genetics, Department of Biopathology and Diagn