多管发酵法测定珠江水的总大肠菌群数..doc

多管发酵法测定珠江水中的总大肠杆菌群数 1 实验目的 综合应用微生物学基本原理和基本实验技术，独立完成培养基的制备与灭菌操作及微生物的分离、观察、描述，掌握多管发酵法测定珠江水的总大肠杆菌群数的实验方法与技术。 2 实验材料 2.1 实验仪器 超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、显微镜、天平等。 培养基：乳糖蛋白胨培养液（分装于10支25ml试管中，内含倒置德汉氏小倒管）、伊红—美蓝（EMB）培养基。 2.2 染色剂 结晶紫液、碘液、95%乙醇、番红溶液 2.3 水样 珠江水样 2.4 其他 报纸、橡皮筋、棉塞、标签纸、无菌水、10.0ml移液管、吸耳球、250ml和100ml锥形瓶、移液枪、培养皿、载玻片、油性笔、接种环、酒精灯、香柏油等 3 实验步骤 3.1 初发酵试验 3.1.1 乳糖蛋白胨培养液的配制与灭菌 将2.76g乳糖蛋白胨粉末溶解于装有120mL蒸馏水的锥形瓶中，充分混匀，然后分装于10支试管中，每支试管装10ml培养液，再用镊子夹取德汉氏小套管，并用小滴管灌满培养液后倒置放入试管中，塞上棉塞，并用报纸包扎好，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，待冷却后使用。 3.1.2 灭菌水的制备 用100ml锥形瓶装80ml自来水，塞上棉塞并用报纸包扎好，于121℃高压灭菌器中灭菌15min，待冷却后使用。 3.1.3 实验器皿的包扎与灭菌 用报纸将初发酵实验用到的10个移液枪头、一支10.0ml移液管包扎好，121℃高压灭菌器中灭菌15min，待冷却后使用。 3.1.4 稀释水样 取5个装有9ml灭菌水的灭菌试管。取1ml水样注入第一管9ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第五管，稀释度分别为10-1，10-2,10-3,10-4,10-5。并贴上做对应的标记的标签。 3.1.5 接种水样 于已灭菌和冷却后的装有10mL乳糖蛋白胨培养液的3个试管中(内有倒管)，分别加入1mL稀释度为10-3的水样；于已灭菌和冷却后的装有10mL乳糖蛋白胨培养液的3个试管中(内有倒管)，分别加入1mL稀释度为10-4的水样；再于已灭菌和冷却后的装有10mL乳糖蛋白胨培养液的3个试管中(内有倒管)，分别加入1mL 稀释度为10-5的水样。共计9管，三个稀释度。同时做空白样品：于1支试管中加入已灭菌和冷却后的10mL乳糖蛋白胨培养液，加1ml灭菌水。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。 3.1.6 观察初发酵结果 培养24h后观察和记录各试管中产酸产气（产酸的培养液会变为黄色）的情况，产酸产气的即为阳性管，并拍照。观察过程中若只见产酸不见产气的话，可轻轻拍打试管壁，产生的气体可能在小倒管内。 3.2 平板分离 3.2.1 实验器皿的包扎与灭菌 用报纸将平板分离用到的培养皿包扎好，于121℃高压灭菌20min，待冷却后使用。 3.2.2 伊红美蓝培养基的配制与灭菌 根据初发酵阳性管的数目：将一定量的伊红美蓝培养基粉末溶解于装有相应量的蒸馏水的锥形瓶中，充分混匀，塞上棉塞并用报纸包扎好，于121℃高压灭菌20min后，倾注已灭菌的平皿，待冷却凝固后使用。 3.2.3 平板划线分离 将培养24h后产酸、产气及只产酸的发酵管分别接种于伊红美蓝培养基上，置于37℃恒温箱内培养24h，挑选符合下列特征的菌落：①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；②紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色，中心色较深的菌落。 3.3 革兰氏染色 取培养24h后且具有上述特征的菌落进行革兰氏染色。 3.3.1 涂片 取一张洁净载玻片，用油性笔在洁净载玻片的边缘上标记，于玻片两端各滴1滴生理盐水，不要太靠近玻片边沿。分别挑取少量培养24h后且具上述特征的菌落的菌种1和菌种2于玻片两端的生理盐水中，并研磨成均匀浑浊的菌液，涂成约1cm×1cm大小的均匀薄膜，接种环灭菌后放回试管架上。 3.3.2 干燥 涂片最好在室温下自然干燥，但考虑到时间问题，我们打算将涂膜背面置火焰上方不烤手的高处加烘烤，但切勿紧靠火焰，以免将涂膜烤焦，细菌变形，染色后难以观察。 3.3.3 固定 涂片干燥后，手持玻片的一端，将载玻片的背面往返通过酒精灯火焰三次，共约2~3秒钟，注意温度不可太高，以玻片加温面触及皮肤感觉烫而尚能忍受为度。 3.3.4 初染 固定完毕且待冷却后滴加结晶紫溶液，1min后用水洗去。 3.3.5 媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 3.3.6 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直到流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 3.3.7 复染 用番红染液复染约2min，水洗。 3.3.8 镜检 干燥后用油镜观