实时定量PCR探究.ppt

* 特异性强，准确性高 对引物和试剂要求不高 常被用作基因含量的精确检测和基因表达变化的精确分析 荧光阀值（threshold）： PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即threshold=10×Sdcycle 3-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。 定义：扩增DNA的量达到荧光阀值时的循环次数。 RNA的质量和定量 引物和探针的设计 内参的正确选择 反应体系的优化 操作规范 序列选取在基因的保守区域 避免引物自身形成环状发卡结构 最好跨两个外显子 引物长度18-24bp 产物长度80-150bp，不超过300bp BLAST分析特异性 引物设计原则同染料法 引物Tm值60 ℃左右，探针Tm值70 ℃，探针Tm值比引物高5-10 ℃，为了确保探针先于引物结合 探针的5‘端不要是G，G有淬灭作用 探针长度为15-45bp 高度或中度表达水平 稳定表达于不同类型的细胞和组织 表达水平与细胞周期或细胞是否活化无关 表达水平与内源性或者外源性的刺激无关 常用内参GAPDH，beta-actin，18srRNA 模板浓度不要太高，反转录最多1ug总RNA PCR一般1ul反转录产物 引物浓度一般100nM-1mM 根据Kit要摸索最佳反应条件 每管或每孔都要换新枪头 每个样品至少要做3个平行孔 每组实验做3个重复 先做普通PCR检测反应条件 组织标本（ug RNA/mg组织）：1-10ug； 培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。 肝组织 处理量30mg， 得率（ug/g组织）4.40， 肾组织 处理量20mg， 得率（ug/g组织）2.20， 心组织 处理量60mg， 得率（ug/g组织）0.27，脾组织 处理量15mg， 得率（ug/g组织）5.30， 脑组织 处理量60mg， 得率（ug/g组织）0.65，肺组织 处理量60mg， 得率（ug/g组织）0.60，肌肉组织 处理量30mg，得率（ug/g组织）0.73， RNA 的降解 OD260 /OD280 比值偏低 电泳带型异常 下游实验效果不佳 新鲜细胞或组织： 裂解液的质量 外源RNase的污染 裂解液的用量不足 组织裂解不充分 另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。 冷冻样品： 样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存，样品要相对小一点； 先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 蛋白质污染： 减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 苯酚残留： 不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。 抽提试剂残留： 确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并彻底去掉75%乙醇。 解决办法:再沉淀一次后，溶解。 设备限制： 测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.10-0.50之间，此范围线性最好。 用水稀释样品： 测OD时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5，用水作为稀释液将导致比值的降低。 非变性电泳： 上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。 变性电泳条带变淡： EB与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。 甲醛的质量不高。 RT-PCR，逆转录PCR或者称反转录PCR，是间接用来扩增从RNA分子得到的一段特异序列。RNA首先被逆转录为cDNA。用位于一段特异序列或者一个基因两侧的引物生成以cDNA为模板的PCR产物成为一个标准的PCR反应。得到阳性产物说明存在着特异的RNA序列。 （1）第一链合成时只能使用基因特异性引物。 （2 ）高灵敏度：使用预混合的反转录酶和DNA聚合酶，可检测到低至0.1pg的mRNA。（3）高便利性：所使用的酶已经预混合。移液步骤少，减少污染机会。 （4）产物长度，3KB。（5）最适于大量样品的分析。 （1）可使用oligo(dT)，随机六聚体引物或基因特异性引物进行第一链合成。（2）高灵活性：可选用不同的酶系统。（3）可优化困难的RT-PCR反应。（4）可实现长模板mRNA的转录扩赠。 （5）最适用于克隆产物(使用高精确度酶或混合酶) 。  实时荧光定量PCR (real-time quantit