实时荧光定量PCR技术及其应用探究.doc

实时荧光定量PCR技术及其应用 摘要：实时荧光定量PCR 技术是在PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效，高通量，而且高敏感性等特点，该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。文章对实时荧光定量PCR 的原理、主要类型、优点、影响因素及应用等进行了综述。 关键词：实时荧光定量PCR 类型 优点 影响因素 应用 实时荧光定量PCR技术(real-time fluores-cence quantitative PCR, RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新技术,它不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,具有灵敏度高、特异性强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。[1]目前，该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域，特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用[2]。 1 实时荧光定量PCR技术的原理 实时荧光定量PCR 的原理是以荧光共振能量转移原理为基础。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct 值是实时荧光PCR 中一个很关键的因素，C 代表循环（Cycle），t代表阈值（Threshold）。每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR 产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与普通PCR 相比，实时荧光定量PCR 可以利用荧光信号实时监测PCR 反应过程中每一个循环扩增产物的变化，可以对初始模板量进行定量分析。 简单地说，实时荧光定量PCR 的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA 含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。 2 实时荧光定量PCR 技术的主要类型 荧光定量PCR 所使用的荧光化学材料可分为两大类，即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBR GreenⅠ为主要代表，是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括TaqMan、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等，属于特异性荧光材料。 2.1 SYBR GreenⅠ SYBR GreenⅠ是一种能够与双链DNA 小沟结合的染料。在游离状态下，SYBR GreenⅠ发出微弱的荧光，但是一旦与双链DNA 结合，其荧光强度大大增强。因此，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA 量成正比，可以根据荧光信号检测出PCR 体系中的双链DNA 的数量[3]。其优点是检测方法简单，通用性好，价格相对较低，是许多实验室开展荧光定量实验的首选。SYBR GreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR 的反应条件、选择设计良好的引物，来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生；另外，也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。 2.2 TaqMan 探针 TaqMan 探针技术是有美国Perkin Elmer（PE）公司研制的一种实时PCR 定量技术，在PCR 扩增加入一对引物的同时加入1 个特异性的荧光探针，此荧光探针为一个30~45 bp的寡核苷酸，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对，其5′端标记荧光发射基团，3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时，3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在PCR 扩增中，模板变性后低温退火，引物与探针同时与模板结合，在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq DNA 聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3 端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和PCR 产物数量是相对应关系，且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量[4]。TaqMan 探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。