SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量..docVIP

项目三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）测定蛋白质分子量 一实训目的 1掌握SDS测定蛋白质分子量的操作步骤 2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 二实训原理 用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X104～16.5X104之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。??? LogMW＝K－bm (LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m为迁移率) 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量. 三、实训器材 序号 设备名称 规格，型号 数量 1 垂直板电泳槽及附件 1 2 直流稳压稳流电泳仪 可变压 1 3 微量进样器 2 4 玻璃注射器 1 5 玻璃平板 4 6 电炉 1 序号 试剂 纯度、浓度 作用 配制方法 需要工具 需要工具 1 低分子量标准蛋白质样本 2mg/ml 以标准样品为对照即可确定样品各区带的成分 见表格下方 水浴锅、小烧杯，玻璃棒 2 样品 10~20mg/ml 作为实验组来测定蛋白质的分子量 同上 水浴锅、小烧杯，玻璃棒 3 浓缩胶缓冲液 呈弱酸性，使甘氨酸解离很少，在电场作用下，涌动效率低，二氯离子含量高，形成较高的电位梯度压着蛋白质聚集在一起，凝缩为一狭小区带。 同上 天平、容量瓶、棕色试剂瓶 4 分离胶缓冲液 呈碱性，甘氨酸解离度大，涌动速率增加，紧随氯离子之后，在电场作用下，蛋白质根据其固有的电性得到分离。 同上 天平、容量瓶、棕色试剂瓶 5 电极缓冲液 保证电泳的PH，起传播电流作用 同上 1000ml的容量瓶、天平 6 过硫酸铵（AP） 1% 作为催化剂，产生自由基，加速凝胶聚合。 同上 天平、容量瓶 7 SDS 1% 去掉其电荷效应，使样品的蛋白质分子的迁移率完全取决于分子量 同上 天平、100ml容量瓶 8 样品缓冲液 同上 天平、100ml容量瓶 9 样本变性液 使蛋白质变性，固定在凝胶上 同上 天平、100ml容量瓶 10 固定液 使蛋白质固定在凝胶上，便于后续过程中色普带的确定 同上 天平、100ml容量瓶 11 染色液 同上 天平、100ml容量瓶 12 脱色液 脱去凝胶上的染色液，使蛋白质谱带清晰 同上 天平、100ml容量瓶 13 保存液 保存凝胶，便于下次使用 同上 天平、100ml容量瓶 14 指示染料液 便于观察蛋白质在凝胶电泳中的位置，有利于调节电流 同上 天平、100ml容量瓶 15 TEMED 加速剂，可催化过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺的聚合 同上 天平、100ml容量瓶 配制方法 1、浓缩胶缓冲液：1.5克Tris、12.0毫升1mol HCl，加水混匀定容至25毫升。 2、分离胶缓冲液：18.15克Tris、48.0毫升1 mol HCl，加水混匀定容至100毫升。 3、电极缓冲液：3克Tris，14.4克甘氨酸、1克SDS，加水混匀定容至1000毫升。 4、1％过硫酸铵：1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中，临用前配制。 5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I＝0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B液)1：7(v/v)稀释。 6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M，2％SDS， 10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；0.8克SDS， 4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升，再1滴0.1％溴酚兰。使用时与样本l:1(v/v)混匀。 7、固定液：57.0克TCA，17.0磺基水杨酸，150毫升甲醇，加水350毫升混匀。 或25％异丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。 8、染色液：1.25克考马斯亮兰R-250，227毫升甲醇，227毫升水，46毫升冰乙酸混匀，滤纸过滤。 9、脱色液：10％乙醇-70％醋酸。100毫升乙醇，70毫升醋酸加水混匀定容至1000毫升。 10、保存液：10％乙醇-10％醋酸-10％甘油，100毫升乙醇，100毫升醋酸，100毫升甘油加水混匀定容至1000毫升。 11、指示染料液：0.1溴酚兰(BPB)，100毫克溴酚兰