第20章高效液相色谱分析.ppt

第20章 高效液相色谱法 本章学习要点 第20章 高效液相色谱法 20-1 概述 20-2 高效液相色谱仪 20-4 液固色谱 20-5 化学键合相色谱 20-6 离子交换色谱与离子色谱 20-7 离子对色谱 20-8 尺寸排阻色谱 20-9 超临界流体色谱简介* 20-1 概述 一、高效液相色谱的特点 二、高效液相色谱的分类 一、高效液相色谱的特点(1) 高效液相色谱与气相色谱的比较 分析对象 流动相 色谱柱温度 分析对象 气相色谱：气体和沸点较低的化合物， 占有机物总数20% 高效液相色谱：高沸点、热稳定性差、 分子量大的物质， 占有机物总数80% 流动相 气相色谱流动相：对组分没有亲和力的惰性气 体，对分离选择性几乎无影响 高效液相色谱流动相：可选用不同极性的液体 选择余地大 对分离影响大（与组分或固定相均作用） 色谱柱温 气相色谱柱温： 一般较高 高效液相色谱柱温：通常为室温 一、高效液相色谱的特点(2) 高压： 150 - 350 ?105 Pa 高速： 一般 1 h, 1min. 高效： 柱效高 高灵敏度： 10-9 g (紫外检测器） 10-12 g（荧光检测器） 超高效液相色谱 3D 图谱比较 一、高效液相色谱的特点(3) 方法的局限性 成本高、环境污染、梯度洗脱操作复杂。 缺少灵敏度高的通用型检测器 复杂样品分离，缺少总理论塔板数达数十万的色谱柱。 受压易分解或变性的生物样品 局限1 成本高、环境污染、梯度洗脱操作复杂。 Solution: 微型化（毛细管色谱柱）、水为流动相等 Nanobore column (0.025 mm ? i.d.? 0.1 mm) Chip column coupled to MS ZORBAX 300SBC18 5 μm particles H.-F. Yin et al., presented at the 18th International Symposium on Microscale Separations and Analysis, HPCE, San Diego, January 2003. Separation of peptides on chip column 局限2 缺少灵敏度高的通用型检测器 Solution: 蒸发光散射检测器 ?Corona电雾式检测器 （Charged Aerosol Detector，CAD） 局限3 复杂样品分离，缺少总理论塔板数达数十万的色谱柱。 Solution: UPLC (UHPLC) 二、高效液相色谱的分类 按分离原理分类： 分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱 尺寸排阻色谱 疏水作用色谱 二、高效液相色谱的分类 按分离规模分类： 制备色谱 柱内径10mm 半制备色谱 柱内径5-10mm 分析型色谱 柱内径 5 mm 电雾式检测器 APCI APPI application 二、保留机理 硅胶的吸附中心 极性相互作用 对试样的保留顺序 选择性 利用多孔凝胶固定相的特性，而产生的一种主要靠分子尺寸大小的差异来进行分离的色谱法 生化分离和高分子科学 多肽、蛋白质、生物酶、多聚核苷酸、多糖等 高聚物如聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯等 SEC的特点 保留体积小于死体积（分配系数1） 保留体积是分子尺寸的函数 固定相与分子间作用极弱（～0） 分辨率低（分子质量差10%） 流体的密度随压力和温度改变而变化 超临界流体的物理性质和化学性质 扩散、粘度、溶解能力都是密度的函数。 只要改变流体的密度，就能改变流体的性质。 超临界流体色谱的程序升密度 （GC程序升温和HPLC梯度淋洗） SFC与GC的比较 谱带展宽小 可改变流动相组成，提高选择性 可测定的相对分子质量范围宽 五、离子排斥色谱 离子排阻色谱 离子排阻分配色谱（ion exclusion partition chromatography) 离子节制分配色谱（ion-moderated partition chromatography) 离子排斥色谱的原理 强阳离子交换树脂与有机酸的作用。 由于Donnan电位的存在，使强酸阴离子受阻于树脂之外，而低电离度的弱酸分子可进入树脂内部，通过与树脂相互作用