[第十一章糖的分析.pptVIP

糖的分析 生命科学与生物医学工程 罗云敬 一、糖的概念 （一）糖类的存在与来源 糖是自然界分布很广的一类化合物，几乎所有的动物、植物和微生物体内都含有糖类。 地球上糖类物质的根本来源是绿色细胞进行的光合作用。 糖类的主要生物学作用 1．可作为生物体的结构物质，如纤维素。 2．可转变为生命所必需的其它物质，如脂类、蛋白质等。 3．是生物体主要的能量来源。 4．可作为细胞识别的信息分子。 （二）糖的化学本质 （三） 糖结构的测定 寡糖与多糖的结构复杂：三个相同的氨基酸只能形成一种形式的三肽，而三个相同的己糖却能构成176种异构体！ 测量的结构包括： 分子量 糖链中糖残基的种类和数量 糖残基结合的位置-连接点 构型 测定方法 早期测定方法： 显色分析法 滴定分析法 基于比重的分析法 现代分析法： 自动化液相色谱法 流动注射分析 离子色谱 毛细管电泳分离分析法 核磁共振 质谱分析法 …… 6.1 糖的结构 淀粉 直链淀粉 分子量约1万-200万，250-260个葡萄糖分子，以?（1?4）糖苷键聚合而成。呈螺旋结构，遇碘显紫蓝色。 支链淀粉中除了?（1?4）糖苷键构成糖链以外，在支点处存在?（1?6）糖苷键，分子量较高。遇碘显紫红色。 6.2 糖的化学分析法 一 羰基的反应 是糖许多定性和定量分析方法的基础 还原法： 糖类化合物的醛基和酮基在溶液中以游离和烯醇两种形式存在，烯醇式糖类是具有一定活性的还原剂。 最常见的还原反应是将Cu2+还原为Cu+，在碱性溶液中形成黄色CuOH，在加热的情况下继续转化为不溶性Cu2O 。 羰基的反应 醛糖和酮糖与芳香胺的反应 醛糖和酮糖在冰乙酸中与不同的芳香胺发生缩合反应生成有色物质。 常用的芳香胺有邻茴香胺、对氨基水杨酸、对氨基苯甲酸、二苯胺和对氨基苯酚等。 芳香胺类化合物对于某一种或者某一类的糖的反应具有选择性。 但是芳香胺类化合物具有致癌性不适合于实验室使用。 与强酸和酚的反应： 戊糖和己糖与强酸和酚一起加热，反应时会分别产生呋喃或羟甲基呋喃衍生物，醛基然后与酚缩合产生有颜色的化合物 6.2.2 多糖的结构分析 化学分析法： 寡聚多糖与碘的反应可以作为一些多糖定性分析的基础 碘与淀粉 蓝色 碘与糖原和糊精 红色 碘与纤维素 无色 过氧化反应 糖类被强氧化剂如高碘酸氧化时，碳链会发生断裂 质谱分析法： 关键问题是离子化：快原子轰击（FAB)、电喷雾离子化（ESI)和基体协助激光解吸离子化（MALDI)软电离技术都适用于糖类分析。 飞行时间质谱（TOF-MS)和傅立叶变换质谱（FT-MS)测大分子糖的分子量要比光散射法或凝胶渗透法精度高得多，特别是LC/MS和MS/MS分析法更有用。 MALDI-TOF/MS用于测量寡糖的分子量，源后衰减技术（Postsource Decay, PSD)用于测寡糖结构。 最有效的方法还是MALDI-FT-MS/MS法。 步骤 酶降解糖复合物，切割寡糖链； HPLC分离纯化 质谱分析 得出结论后，用其他方法核证，如GC/MS,MS/MS和NMR等 6.3 糖的酶法分析 当化学分析法达不到分析特异性的要求，采用酶分析法 通常可以在各种异构体的混合物中实现对某一种的选择性测定，并能区分α和β构型 常用的酶： β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、 α-半乳糖苷酶等 6.3.1 基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖分析 β-D-葡萄糖+O2+H2O D-葡糖酸+H2O2 α-D-葡萄糖被氧化的反应速率低于β-D-葡萄糖的1% α-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖两种异构体以平衡的形式存在，在变旋酶的作用下α向β不断转化，最终使得反应进行完全。 基于显色反应的过氧化氢分析 上述反应所产生的过氧化氢可以用显色法测定，最早用的底物为邻-连甲苯胺和邻-茴香胺，但是具有致癌性，已被取代。 但是要注意避免过氧化物酶的干扰，它可以使过氧化氢变为水和氧气。 基于电化学的过氧化氢分析 是葡萄糖分析仪的基础 分析速度快，一分钟之内就可以完成，而且试剂及样品的消耗少（10μl）。 6.3.2 基于葡萄糖脱氢酶或己糖激酶的葡萄糖分析法 葡萄糖脱氢酶 β-D-葡萄糖+NAD+/NADP+ 葡萄糖酸内酯+NADH/NADPH 利用动力学法或固定时间法测定产物NADH在340nm处的吸收 分析时要用变旋酶加速α型向β型D-葡萄糖的变化 己糖激酶 6.3.3 其他己糖分析方法 6.4 糖混合物的分离鉴定 6.4.1 纸色谱及薄层色谱 糖的样本一般溶于异丙醇中，质量浓度大约为2g/L，点样量一般为10μl 定义葡萄糖的Rf值为100 分离之后一般要经过显色反应以确定糖的位置，使用不同的显色剂有助于未知斑点的鉴定 显色是采用喷雾或浸入，