张绍阳20130524《分子生物学》实验讲稿20130223..docVIP

铜仁学院 Tong ren xue yuan 讲 稿 课 程 分子生物学 实验 专 业 生物科学科 年 级 2010级 教 师 张 绍 阳 职 称、学 位 讲 师 博 士 部系、教研室 生物科学与化学系植物教研室 2012至2013学年度第二学期 实验1 CTAB法提取植物基因组DNA 实验目的和原理 1 基因组DNA提取实验意义 基因组DNA提取是植物生物技术的基本环节，所得DNA可用于基因克隆、分子标记分析、基因文库构建以及Southern杂交等试验操作。 2 基因组DNA提取方法 关于植物基因组DNA提取的方法有诸多文献报道，但基本步骤和原理是相近的，其提取液主要成份不外乎两种试剂，即十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethyl-ammonium bromide，CTAB）和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），并以CTAB为多。本次实验介绍CTAB法提取植物基因组DNA原理和相应方法。 3 基因组DNA提取CTAB法基本原理 植物组织是由多种组分构成的，如糖、脂类、蛋白质、DNA和RNA构成。提取基因组DNA就是要先将组织细胞进行破碎，然后通过试剂作用和离心作用将其余杂质去除。植物组织经液氮粉碎后用含表面活性剂的CTAB提取液提取，经氯仿抽提，DNA和RNA得到回收而蛋白质及细胞碎片和脂溶性杂质得到去除。经有机溶剂沉淀，DNA和RNA得以沉淀而水溶性杂质被去除。RNA经RNase处理可被降解，最终获得基因组DNA。 以下是提取方法和基本步骤。 4. 本实验要掌握事项：移液器使用注意事项、离心机操作注意事项 二、实验材料、试剂、仪器及用具 　1. 实验材料及选取标准：健康无病虫害的植物鲜嫩组织，通常是芽和未完全展开的幼叶。思考题：为什么要选用鲜嫩组织？说明不同植物材料DNA提取难易程度有显著差别。本实验实验材料为：青瓯柑幼叶。 　2. 试剂种类及其作用 2.1 试剂种类： 液氮、2×CTAB提取缓冲液、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（水不溶性）、β-巯基乙醇、氯仿:异戊醇（24:1）、酚: 氯仿:异戊醇（25:24:1）、异丙醇、70%乙醇、RNase（10mg/ml）、TE缓冲液等。 2.2 试剂作用：（1）液氮和PVP。液氮就是保持研磨时低温降低组织内生理生化反应，同时使得组织变脆易于研磨。PVP是防止组织发生醌类反应而褐化。 （2）2×CTAB提取缓冲液（由2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl , 20 mmol/L EDTA, 1.4 mol/L NaCl, pH 8.0)，其作用就是细胞破碎，基因组DNA从核内游离出来；其中，EDTA成分为DNase抑制剂，防止DNA被该酶降解。β-巯基乙醇，在提取前CTAB溶液中，具有抑制氧化作用，其具有臭鸡蛋难闻气味。加入该试剂要在通风厨内进行。 （3）氯仿:异戊醇（24:1），该溶液密度比水大，其作用去除叶绿素等脂溶性物质，包括糖和大部分蛋白质。 （4）RNase A ,其作用就是去除RNA （5）酚: 氯仿:异戊醇（25:24:1）,去除蛋白质，尤其是染色体上的组蛋白 （6）异丙醇，使DNA沉淀。用前要-20度低温遇冷半小时或更长时间。 （7）乙醇，漂洗DNA，使得到的DNA更为纯净 （8）TE缓冲液（10 mM Tris和 1 mM EDTA，pH8.0）。溶解DNA。溶解完毕的DNA溶液，即为最终提取产物。也可以用超纯水（或双蒸水）进行溶解。在TE缓冲液中，DNA更为稳定。 　3. 仪器及用具：冷冻离心机、研钵、移液器、通风厨、水浴锅等。分子生物学实验中，氯仿、甲醛、醋酸、?-巯基乙醇，都具有刺激性气味，进行相关操作时要在通风厨内进行。 三、实验步骤（实验操作顺序，以一A1小小组为例） 1. 一A1-1 加提取缓冲液。 将600 ?l 2×CTAB提取缓冲液和20 ?l ?-巯基乙醇加入1.5 ml 离心管中（在通风厨内进行）, 将该离心管放入65℃水浴中进行预热。 　2. 液氮研磨组织。取适量植物组织（约0.5-1.0g），加入适量PVP，于液氮中研磨成粉末。（已有研磨好样品，在本实验中，此步骤已省略） 3. 一A1-2 65℃水浴45-60 min。取0.10-0.12g研磨好的组织粉末，转入提取液已预热过的离心管中，盖好盖子后，旋窝震荡10-15s左右，然后随浮板放入在65℃水浴中保温45-60 min, 并每隔10-15min颠倒混匀10