REACH法规第五卷译稿-4..docVIP

C.3. 海藻抑制实验 1. 方法 1.1. 引言 本实验的目的是测定化学物质对于单细胞绿藻的生长影响。相对短时间(72小时)的测定可以估计对几个世代的作用。 本方法适用于几个单细胞藻类，方法描述必须和实验报告一起提供。 本方法对于水溶性物质的应用最为简单，该水溶性物质在实验条件下在水中存在。 本方法可用于不直接影响测试海藻生长的物质。 在实验前有必要尽可能掌握这些物质的水溶性、蒸汽压、化学稳定性、溶解常数和生物降解率等数据。 在设计测定方法和分析结果时还应考虑到其它信息（例如结构式，纯度，主要杂质的种类和百分比，添加物的存在和数量和正辛醇/水分配系数）。 1.2.定义和单元 细胞密度：每毫升的细胞数； 生长：实验过程中细胞密度的增长； 生长速率：单位时间内细胞密度的增长； EC50：本方法中，导致相对于对照实验生长（EbC50）或生长率（ErC50）降低50%的物质浓度； NOEC (无现象浓度)：本方法中，相对对照实验未能引起明显抑制生长作用的最高物质浓度。 所有被测物质浓度用重量体积比表示（mg/L）。也可以用重量比（mg/kg）表示。 1.3 参考物质 可以作为测定的参考物质指的是在实验室测定条件下，测定物的敏感度没有显著的变化。 如果使用了参考物质，在实验报告中必须指出结果。 重铬酸钾可以用作一种参考物质，但它的颜色可能会影响照射细胞的光的质量和强度，以及会影响到可能使用的色谱测定法。 重铬酸钾被应用于一国际间实验室测试（见参考文献（3）和附录2）。 1.4. 测定方法原理 极限测试需用100毫克每升进行测定从而保证EC50值大于此测定浓度。 选定的呈指数级生长的绿藻在实验特定的条件下，在各种浓度的被测物质中培养几个世代。 培养测定溶液72小时，在此过程中至少每24小时测定一次每份溶液的细胞密度。这样就可以测定相对于对照实验的海藻生长的抑制作用了。 1.5. 定量标准 定量标准适用于极限测试和整个测定方法和过程。 对照实验的培养必须使细胞密度在3天内增长16倍。 本实验过程中，测定物质的浓度应保持不少于起始浓度的80％。 对于那些易溶于测试介质体的物质，溶解后形成稳定的溶液而且不发生显著的挥发、降解、水解或吸收的，可认为起始溶液浓度为标定浓度值。要有证据能表明测定过程中浓度保持稳定并符合定量标准。 对于以下物质： (i) 在测定介质中溶解性差，或 (ii) 能形成稳定的乳状液或悬浊液的，或 (iii) 在水溶液中不稳定的， 起始浓度应在测定开始时在溶液中进行测定。 浓度测定应在反应平衡一段时间后进行。 在这些情况下，在测试中应采取进一步措施确定接触物质的实际浓度，满足定量标准。 实验中可能观察到，显著数量的被测物质与海藻会有所结合。所以，为了证明与以上的定量标准一致，与海藻结合以及溶液（或者，若技术条件不允许，应在水柱中测量）中的物质的量都要考虑。 然而，由于测量与海藻结合的物质的量带来明显技术上的问题，所以，要证明与定量标准一致，可以在最大浓度下不加海藻进行实验，在实验开始和最后测量测量浓度（或者，若技术条件不允许，应在水柱中测量）。 1.6. 测定步骤描述 1.6.1. 试剂 1.6.1.1.测定物质溶液 一定离子强度的储备液用去离子水或符合1.6.1.2标准水溶解测定物配制。 加适当分量的溶液于海藻预先培养（见附录1）中，配成实验所选择的浓度。 通常测定的物质浓度取决其溶解度。对一些物质（其水溶解度低或有高Pow值或形成的溶液实际为稳定的分散液的），可以不受其溶解度所限进行测定，从而保证获得其最大的可溶稳定浓度数据。需要注意的是，该浓度下测定系统不被破坏。（例如在水面上盖上薄膜以防止水的氧化等） 超声波分散，有机溶剂，乳化剂或分散剂可辅助用于一些水溶性差的物质储备液的配制，或有助于物质在介质中的分散。当使用这些辅助物质时，测定浓度应包括相同数量的辅助物质，同时对照组中也应使用相同数量的辅助物质。辅助物质的浓度应尽可能低，任何情况下在测试介质中不得大于100毫克每毫升。 测定过程中pH值不应改变。如果有显著证据表明pH 值发生了变化，建议调整pH值重新进行测定并报道结果。在这种情况下，除非有特殊原因储备液的pH值应调整至稀释水的pH值。最好用HCL和NaOH调节pH值。pH值调节过程中，储备液中被测物的浓度不应发生显著变化。如果调节过程中，测定化合物发生化学反应或物理沉淀现象应予以记录。 1.6.1.2.测试介质 分析用水都是优质的蒸馏水或者是电导率小于5μScm-1的水。 蒸馏仪器不得含有任何铜制造的部件。 以下为推荐使用的介质。 根据以下表格配制四份储备液。储备液用表层过滤或高压灭菌，在黑暗及4°C环境下保存。储备液4只能用表层过滤灭菌。这些储备液将被稀释到最终的营养测定溶液浓度。 营养物