蛋白质电泳分离分析.pptVIP

* * * * 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质4学时 通过实验使学生掌握电泳的基本原理 熟悉薄膜电泳的基本操作 一、 实验目的 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的原理 二、实验原理 1、电泳法 是指带电粒子在外电场的作用下，向 着与其电性相反的电极移动的现象。 如：不处于等电点的蛋白质分子带电荷。 pH=pI OH- pHpI H+ OH- H+ pHpI 蛋白质的兼性离子 阳离子 阴离子 CH NH COOH R CH NH 2 COOH R CH NH COO R CH NH 2 COO- R CH NH COO R CH NH 3 COO- R + CH NH COOH R CH NH 3 COOH R + 2、电泳技术 是利用样品中各带电粒子在电场中的迁移速度不同，从而对样品中分子进行分离、鉴定、纯化和制备。 外在因素 电场强度、 溶液的pH值、 溶液的离子强度、 电渗现象 影响电泳迁移率的因素 粒子所带净电荷的量、大小和形状 内在因素 3、电泳的分类 依据支持物的性质不同： 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作支持物的一种区带电泳技术。 该膜具有均一细密微孔结构，对分子移动阻 力小，作为区带电泳的支持物，它具有操作简便、 快速、样品需要量少，应用范围广等优点。不足 之处是分辨率比聚丙烯酰胺凝胶电泳低，薄膜厚 度小不适于做样品制备用。 血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。 清蛋白 α1球蛋白 α 2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 pI 4.88 5.06 5.06 5.12 6.85-7.3 泳动度(cm2/s.v) 5.9×10-5 5.14×10-5 4.1×10-5 2.8×10-5 1.0×10-5 分子量(kD) 69 200 300 90-150 156-300 4、血清蛋白的种类 PH8.6缓冲液中带负电荷 电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条区带，每条带代表一种蛋白质。 结果示意图： γ β α2 α1 清蛋白 三、实验器材与试剂 1.器材： 电泳仪、电泳槽、醋酸纤维素薄膜(2X8cm)、毛细管、培养皿、载玻片、 粗滤纸、镊子，烧杯，量筒，铅笔。 2.试剂： 新鲜人血清（无溶血现象） PH8.6缓冲液：巴比妥1.66g、 巴比妥钠12.76g、加水至1000ml，置4℃冰箱保存。 染色液：氨基黑10B 0.5g、 甲醇50ml、 冰醋酸10ml、蒸馏水40ml，混匀溶解贮存。 漂洗液：95％乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml、混匀。 浸泡 电泳槽准备 点样 电泳 脱色 染色 五、实验过程 1.浸泡：在薄膜粗糙面距一端2cm左右处用铅笔轻轻划一条直线，表示点样位置。将薄膜粗糙面向下，浸泡于PH8.6的巴比妥缓冲液中至少十分钟，使之完全浸泡透。 2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。 3. 点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后铺在干净的平皿盖上(粗糙面点样)，将毛细管在血清中沾一下，封住上端，在载玻片的一端均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把载玻片在薄膜粗糙面上点样位置轻而温和地印一下。 2cm 4.电泳：将薄膜粗糙面朝下，平行扣于电泳槽支架的滤纸桥上，膜条点样的一端放在负极上，膜条与滤纸必须贴紧，平衡5分钟后通电。调节电压至90-120V左右，电流强度为0.4—0.6mA/cm，电泳时间40min-1h。 5.染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡2-5分钟。 6.漂洗：将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗3-4次至无蛋白区底色脱净为止，可得到色带清晰的电泳图谱。 五、实验结果与分析 预期结果 一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。 ? ? 清蛋白 ?1 ?2 ? ? 实际结果 失败图谱的分析 ? 拖尾状：点样量过多，被分离的血清蛋白不能分离成5条区带或产生拖尾。 ? 有斑点：点样不均匀，不整齐，导致被分离的区带出现斑点。 ? 边流现象：点样板蘸取血清一边多一边