第2蛋白质.ppt

3.蛋白质的沉淀反应 蛋白质在水中形成了稳定的胶体， 如果加入适当的试剂，破坏了蛋 白质的水膜（水化层）或中和了 蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶 液就不稳定而出现沉淀。 ① 加入中性盐 若在蛋白质溶液中加入少量的中性盐，则蛋白质的溶解度会增加，这种现象叫盐溶。 分子在其pI时，容易互相吸引，聚合沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。 3.蛋白质的沉淀反应 若在蛋白质溶液中加入大量的中性盐，使蛋白质沉淀析出的现象叫盐析。（用于分离纯化蛋白质） 蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，当盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，形成沉淀。 ②加入有机溶剂 向蛋白质溶液中加入有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮）会使蛋白质沉淀，原因是： ——这些有机溶剂与水的亲和力大于蛋白质，破坏了蛋白质周围的水膜； ——有机溶剂的介电常数比水小，导致溶液的极性减小，增加了蛋白质之间的静电吸引力，从而聚集沉淀。 ③加入重金属 如HgCl2 、AgNO3 、Pb(Ac)2 、FeCl3 等 ④加入生物碱试剂 如鞣酸、单宁酸、苦味酸、三氯醋酸 总之，破坏了蛋白质胶体的稳定条件之一——水膜或中和电荷，就可使蛋白质沉淀析出。 哪些沉淀为可逆沉淀？ 哪些沉淀为不可逆沉淀（变性沉淀） 4.蛋白质的变性和复性 天然蛋白质受到理化因素的影响，分子内部严格的空间结构受到破坏，从而引起蛋白质的理化性质和生物学性质发生改变，但并不导致蛋白质一级结构的破坏，这种现象称为蛋白质变性作用。 蛋白质变性的因素有： ①物理因素——加热（70－100℃）、剧烈振荡或搅拌、紫外线、X射线、超声波 ②化学因素——强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、甲醛、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇 蛋白质变性的本质是： ①维持蛋白质高级结构的次级键被破坏； ②蛋白质分子从有序卷曲结构变为无序松散结构； ③一级结构没有变化，分子量和分子组成不变。 变性蛋白的特征： ①生物活性丧失（最主要）； ②理化性质改变——溶解度下降，易沉淀、结晶能力丧失、粘度增加、扩散速度下降等; ③生化性质改变——肽链松散、反应基 团增加、易被蛋白酶水解。 变性条件若不过于激烈，一旦条件去除，则变性蛋白恢复原来的构象，这种现象叫作变性蛋白的复性作用(renaturation)。 核糖核酸酶A 5.蛋白质的颜色反应 ①双缩脲反应(Biuret Reaction) 双缩脲在碱性溶液中与CuSO4作用产生紫红色络合物的反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多类似双缩脲结构的肽键,所以也能发生双缩脲反应。(可定性定量分析蛋白质） ②黄色反应 蛋白质遇浓硝酸会变黄，这一反应为Phe、 Tyr、Trp等含苯环的氨基酸所特有。 ③米伦氏反应(Millon Reaction) 蛋白质溶液中加入米伦试剂(HgNO2 、HgNO3 、 HNO3和HNO2的混和液)，产生白色沉淀，加热 则变为红色沉淀，此为Tyr的酚基所特有的 反应，因此含有Tyr的蛋白质均有此反应。 ④水合茚三酮反应(Ninhydrin Reaction) α－氨基酸与水合茚三酮作用时，产生蓝紫色反应，由于蛋白质是由许多α－氨基酸组成的，所以也呈此颜色反应。(可定性定量分析蛋白质） ⑤其他颜色反应 乙醛酸反应会产生紫色环，用于鉴定含Trp的 反应；坂口反应会产生红色产物，用于鉴定 含Arg的反应；酚试剂反应是酚试剂与蛋白质 反应产生蓝色化合物。 6.蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的Phe、Tyr、Trp(共轭双键体系)。 这三种氨基酸在280nm 附近有最大吸收峰，因此大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。 常用方法： 沉降速度法、 凝胶过滤层析、 SDS。 八、蛋白质分子量的测定 蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，离心管底部的蛋白质浓度增高，这就是蛋白质的沉降现象。 在离心时，蛋白质分子在单位时间内下沉的距离为沉降速度，它与蛋白质分子的大小、形状和密度，溶液的密度、粘度有关。 根据沉降速度求出沉降常数（s)，代入公式： M=RTs/D(1-Vp ) M:质量 R:气体常熟 T：温度 D：密度 1.沉降分析法(Sedimentation Analysis, 也叫超速离心法） 沉降常数又称沉降系数，即每单位离心场沉降分子下沉的速度，其单位为S（svedberg unit),它表示沉降分子的大小特性，1S=1×10-13秒。 血红蛋白沉降系数4.46×10-