酶聯免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项.pptVIP

* AP 磷酸酯酶 * 酶联免疫吸附试验（ELISA）手工操作注意事项 酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例） ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。 影响酶联免疫测定的因素较多, 诸如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、孵育温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等一系列问题均有可能对试验结果产生很大的影响, 只有避免了这些因素, 才能保证试验结果的准确性和可靠性。 一、移液枪的使用 1. 样品准备 （1） 吸样之前要保证移液枪、枪头和液体处于相同温度。置于冰箱保存的样品应提前取出，室温放置，使温度平衡后再吸样。 液体温度 吸头温度的 移取的液体体积会 偏大 液体温度 吸头温度的 移取的液体体积会 偏小 （2） 若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便吸取。 2. 体积设定 大体积 ? 小体积 逆时针 精度最佳 小体积 ? 大体积 顺时针 调至超过设定刻度，再回调 可保证最佳的精确度 严格的精确调节方法 3. 装枪头 将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可 上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散， 甚至会导致调节刻度的旋钮卡住 4. 吸液 （1） 垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。 （2） 枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸嘴内壁液体吸附达到饱和，再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。 一般液体，正向吸液（一档?二档）。 粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档?一档）。 正向吸液 反向吸液 （3） 缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，导致移液体积不准确和腐蚀枪体。 （4） 吸取后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察是否有液滴缓慢地流出。若有流出，说明有漏气现象（原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气密性不好）。 （5） 吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。 5. 放液 （1） 将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40°倾斜。 （2） 平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟?二档，排出剩余液体。排放致密或粘稠液体时，压到一档后，再多等一两秒钟?二档。 （3） 压住按钮，同时提起移液器，使吸嘴贴容器壁擦过。 （4） 松开按钮。 （5） 按弹射器除去移液嘴。 （6） 使用完毕。 移液枪的养护及注意事项 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。 移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。 不得用移液枪移取有腐蚀性的溶液，如强酸、强碱等。 如有液体进入枪体，应及时擦干。 千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏移液枪。 移液枪长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，保持松弛状态，延长移液枪的使用寿命。 应定期对移液枪进行校准。 二、ELISA具体操作 1 标本的收集和保存 2 试剂的准备 3 加样本及反应试剂 4 温育 5 洗板 6 显色 7 比色 8 结果判断 1 标本的收集和保存 未抗凝血标本离心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温（20－25℃）放置30－60min，血标本可自发完全凝集，析出血清；或37℃水浴20－30min，析出血清。 以3000r/min转速离心5－10min，使血清分离完全。 若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，并且不易洗去，可与酶标记物非特异性结合，造成假阳性。 1 标本的收集和保存 （1）要注意避免出现严重溶血、脂血标本。 血红蛋白中铁卟啉具有类似过氧化物酶的活性，因此，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高，则其很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的底物反应，从而产生非特异性显色。 脂血标本血清中大量的脂质小粒易黏附于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如乳化剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干扰。 1 标本的收集和保存 （2）血清标本宜在新鲜时检测，要注意尽量避免细菌污染。 血清标本如在冰箱中保存过久，IgG可发生聚合，AFP可形成二聚体，使本底加深，产生假阳性反应。 细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性