第04章标记物及其与抗原抗体的结合物制备分析.ppt

第七节 稀土离子与抗原抗体的结合物制备 一、基本方法 镧系元素离子不能直接与抗原或抗体分子结合，需利用具有双功能基团的螯合剂。 常用的双功能螯合剂有1-（对-苯偶氮）-EDTA、异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-EDTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等。 螯合剂可先螯合EU3+，再连接蛋白质（一步法），或先连接蛋白质，再螯合EU3+(二步法)。针对小分子半抗原，则需先将半抗原与大分子载体蛋白（牛血清白蛋白、多聚赖氨酸等）连接，再标记EU3+。 第八节 量子点与抗原抗体结合物制备 一、基本方法 量子点与抗原、抗体等生物分子偶联的方法主要有静电吸附法、生物素-亲和素法及共价结合法。 共价结合法亦称双功能交联试剂法，通过化学反应将量子点表面进行羧基、氨基、羟基或环氧基等活性基团修饰改性，使之能与生物分子共价偶联。 量子点表面含有羧基的偶联方法主要是混合酸酐法和碳二亚胺法。 含有氨基的偶联方法主要是戊二醛法。 表面功能基团为羟基的量子点偶联主要通过琥珀酸酐法实现。 二、量子点标记结合物的纯化 纯化目的主要是：除去多余的交联剂、未交联的抗体以及未结合的量子点。 多余的抗体可采用凝胶柱层析法或50%饱和硫酸铵沉淀提纯法去除。 溶液中未反应的小分子，如偶联剂、抗体、量子点分解产物等可采用透析法去除。 不同偶联比例量子点探针的分离，可根据颗粒大小不同，其进一步纯化可以采用凝胶过滤法、高效液相色谱等方法进行分离。 三、量子点标记结合物的鉴定 量子点与抗原抗体结合物的鉴定可从光谱学特征、凝胶电泳、荧光成像、凝胶柱层析、点印记亲和分析等方面展开。 偶联前后量子点的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱特征的变化、SDS凝胶电泳、荧光镜下成像等，可证明结合物偶联成功。 点印记亲和分析等抗原抗体结合试验可证明结合物免疫活性。 G-100葡聚糖凝胶柱可证实结合物偶联的有效性。 第九节 胶体金与抗原抗体的结合物制备 一、基本方法 胶体金标记就是蛋白质等大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。 吸附的可能机理是胶体金颗粒具有高电子高密度的特性，其表面的负电荷能与蛋白质的正电荷基团静电吸附而牢固结合。 这种结合过程主要是物理吸附作用，不影响被标记分子的生物活性。 二、胶体金标记结合物的纯化、鉴定 除去未标记的蛋白、未充分标记的胶体金以及在标记过程中形成的聚合物，可采用超速离心法或凝胶过滤法。 一是用有支持膜的镍网蘸取胶体金标记蛋白，在电镜下测量颗粒的平均直径；二是用免疫组化滤纸模型鉴定特异性和敏感性。 本章小结 临床免疫分析技术常用的标记物有放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂、胶体金、量子点、三价稀土离子等。 三价稀土离子铕是标记抗原抗体应用最广的镧系元素，其特性为有较大的Stokes位移，荧光寿命长。 量子点由II-VI族或III-V族元素组成，其光学特性为：激发光谱宽而连续、发射光谱窄而对称，发光效率高、光化学稳定性好，发射光颜色与粒径大小关联等。 本章小结 交联剂分子两端各有一个相同或者不同的活性基团，它们可与其他分子上的氨基、巯基、羟基等基团发生共价结合而产生交联作用。 根据其两个反应基团是否相同分为均一的和非均一的交联试剂。 常用的双功能交联法有：碳二亚胺缩合法、戊二醛法、N-羟基琥珀亚酰胺活化法、混合酸酐法、过碘酸盐氧化法、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸醋(SPDP)法等。 本章小结 标记结合物的纯化方法主要有凝胶柱层析、透析、硫酸铵沉淀法、离心法等，也可以采用高效液相层析、电泳及离子交换柱层析进行分离纯化。 标记结合物的鉴定主要从标记结合比率、免疫活性、标记物活性等方面进行。 * * SPDP交联法优点 对蛋白质的伯胺基和脂肪族链上的游离巯基反应敏感，专一性很强，反应容易控制，可避免副反应。 交联的程度容易测定，交联后的大分子生物活性高于一般交联剂方法。 可通过还原裂解使其再生。 第三节 放射性核素与抗原抗体结合物的制备 重点提示 标记物与抗原抗体结合物的制备基本方法 标记物与抗原抗体结合物的纯化 标记物与抗原抗体结合物的鉴定 标记物与抗原抗体结合物的保存 放射性核素与抗原抗体的结合物制备 一、基本方法 氯胺T(ch-T)法是常用的标记方法，氯胺T是一种氧化剂，它能使125I+液中带负电荷的碘离子氧化成带正电荷的碘，然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上的氢 ch-T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物钠盐，在水中易分解成具氧化性的次氯酸：次氯酸可将125I﹣氧化成带正电荷的125I+，后者可取代抗原（或抗体）中酪氨酸残基苯环上的氢原子，形成稳定放射标记物；最后加入还原剂偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）可终止反应 125I结合物制备 直接标记法—氯胺T法 化学或酶促反应，将放 射性负电碘离子氧化成 碘原子或正电碘离子， 通过取代反应