实验一PCR扩增基因.pptVIP

实验九 PCR扩增检测转基因大豆、玉米 【实验目的】 通过PCR扩增方法检测市场常见大豆、玉米产品是否含有转基因成分 培养学生的实验设计能力和创新能力 【实验原理】 【实验步骤】大豆、玉米DNA 提取--改良的CTAB法 称取0.1g样品，在研钵中充分研磨。加入1000μL CTAB提取液，继续研磨充分后加入到1.5mL Ep管中；向EP管加入4μL RNaseA，至于65℃水浴，过程中混匀3~5次，30min，12000r/min室温离心10min；取上清于新的Ep管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24: 1)，轻缓颠倒数次(或至于漩涡震荡器上混匀)，室温静置5min，室温12000r/min离心10min；重复加入氯仿异戊醇一到两次 (过程中如上清液量太少，可适量加入三重蒸馏水)；取上清于新的Ep管(千万不要吸入下层液体)，再加入等体积的CTAB沉淀液，轻缓颠倒混匀后室温静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上清液，加入400μL 1.2mol/L氯化钠溶解沉淀，56℃温浴15min，期间轻摇EP管数次助溶；加入800μL -20℃无水乙醇，-20℃静置1h，15000 r/min室温离心10min；弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两三次后，在室温下自然风干用三重蒸馏水溶解储存于4℃。 【实验步骤】基因组DNA浓度和纯度的鉴定 取5μL样品溶于95μL三重蒸馏水中，用 Biophotometer分析DNA的浓度，通过它对提取大豆DNA测OD值。并记录数据。由OD260nm/OD280nm判定基因组DNA的浓度，其比值在1.7~2.0之间较好，符合PCR检测要求。 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 它包括: 变性(Denature) 、 退火(Anneal)和延伸(Extension)三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。 主要试剂 Taq DNA polymerase 底物：10mMdNTP 引物对：1μmol/L PCR缓冲液 ddH2O 主要实验器材 PCR主要操作步骤 标记试管 加入各种试剂、混匀、离心（最后加酶） 设立PCR循环程序，进行扩增 标记PCR反应管 加入试剂 【实验步骤】 1. 在0.2 mL Eppendorff管内调制50 μL反应体系： 反应管放入PCR仪 编辑程序进行扩增 2. 按下述程序进行PCR扩增: 1） 94℃ 预变性 3 min； 2） 94℃ 变性 1 min； 3） 54℃ ( 或者56℃ )退火 45 sec； 4） 72℃ 延伸 1 min； 5） 重复步骤2~4, 29次； 6） 72℃ 延伸 10 min； 7） End. 3. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果 配制0.8％琼脂糖凝胶，取PCR产物5μL加1μL点样液混合后点入上样孔，于120V电压电泳20~30min。电泳结束后，用自动凝胶成像分析系统检测 【思考题】 1、影响PCR反应效率的因素有哪些？ 2、为什么检测转基因大豆或者玉米时，以大豆凝集素(Lectin)基因、玉米特异性内源基因IVR为内参 ？ * * 以大豆特异性内源基因大豆凝集素(Lectin)基因或者玉米特异性内源基因IVR为内参， 花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S启动子)、农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)及外源基因5-烯醇丙酮-莽草酸-3-磷酸合酶(CP4-EPSPS)基因为靶基因检测大豆和玉米中的转基因成分。 内源基因 内源基因 外源基因 外源基因 外源基因 118 bp 226 bp 195 bp 180 bp 320 bp p1：5’-gcc ctc tac tcc acc ccc atc c-3’ p2：5’-gcc cat ctg caa gcc ttt ttg tg-3’(54 ℃) p3：5’-ccgctgtatcacaagggctggtacc-3’ p4：5’-ggagcccgtgtagagcatgacgatc-3’ (56℃) p5：5’-gat agt ggg att gtg cgt ca-3’ p6：5’-gct cct aca aat gcc atc a-3’ (54 ℃) p7：5’-gaa tcc tgt tgc cgg tc