【2017年整理】二甲双胍对乳腺癌细胞活性氧的影响.docVIP

二甲双胍对三阴性乳腺癌细胞活性氧的影响及诱导凋亡的作用 [摘要] 目的: 研究二甲双胍对三阴性乳腺癌细胞活性氧的影响以及其诱导凋亡的作用。方法:使用不同浓度药物联合处理MDA-MB-231细胞，MTT 法检测药物的生长抑制效应； PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡；集落克隆形成实验观察二甲双胍对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖作用的影响；流式细胞仪检测细胞内超氧阴离子含量；MTT法检测二甲双胍联合细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂对细胞增殖的影响。 结果: MDA-MB-231细胞经过1.25、、、、mmol/L 二甲双胍作用24、48、72h mmol/L二甲双胍处理的MDA-Mb-231细胞凋亡率分别为0.1%，2.9%，6.9%，17.7%；集落克隆形成实验结果表明，二甲双胍对MDA-MB-231细胞的增殖有抑制作用。与对照组相比，二甲双胍组细胞内超氧阴离子含量显著增高；二甲双胍联合细胞内活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)Metformin）是2型糖尿病患者常用口服降糖药。2005年Evans等[1]研究发现二甲双胍可降低糖尿病患者恶性肿瘤的发生率。有研究证实二甲双胍对于多种实体肿瘤均有不同程度的增殖抑制的作用[2-5] ，但对于三阴性乳腺癌细胞（triple negative breast cancer, TNBC）MDA-MB-231：购上海细胞库DMEM培养基、、Gibco 公司产品）、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、Triton X-100美国Sigma公司NAC（中杉金桥生物技术），Caspase- 3检测试剂盒（碧云天生物技术所）。恒温二氧化碳培养箱( SHELLLAB 公司， 美国），倒置显微镜( Olympus 公司，日本) ，净化工作台( 上海浦东物理光学仪器厂，上海)，DG3022型酶联免疫检测仪（南京华东电子管厂），流式细胞仪（BD Flow cytometers Reagents）台式离心机(美国Fisher公司)MDA-231在高糖型DMEM培养基中培养（含10％FCS，2.0g/L碳酸氢钠，20mmol/L Hepes，0.6μg/ml胰岛素，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素），37.0℃、5％CO295％CO2培养箱培养传代培养，1～2MDA-231细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调细胞为×104/ml，96孔板每孔接种细胞悬液00μl，于5% CO2孵箱中24 h后细胞换液，加入药物，每孔设5个复孔。、、、、mmol/L）。继续孵育24 h 48 h和72h每孔加MTT5 mg/ml)溶液20μl，继续孵育。4 h后弃，每孔加DMSO 100μl，振摇5 min后，570 nm波长下每孔的吸光度( A) 值。24 h 后加入0，5，10，20 mmol/L二甲双胍，继续培养48 h 后，收集各孔培养液到对应流式管中，冷PBS清洗，收集清洗液到对应培养液中，胰蛋白酶消化，收集消化液到对应流式管中，冷 PBS 清洗，收集清洗液到对应流式管中，1200r／minμl的PI缓冲液 ( 5 mg PI 0. 1 g 柠檬酸钠 100μL Triton X100 100 ml d H2 O)，37℃孵育10 min，4℃避光过夜，上流式细胞仪检测（亚G1期DNA 含量的细胞比例，代表凋亡率）。 1.2.4细胞集落形成测定 取对数生长期MDA-231细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调细胞为×104/ml，每孔接种细胞悬液00μl，5% CO2孵箱24 h后细胞换液，加入药物。孵育4%多聚甲醛-20℃固定，弃固定液，结晶紫染色，双蒸水洗去染色液，室温干燥。 1.2.5流式细胞仪检测细胞内ROS含量：细胞处理方法与凋亡率检测相同。实验分组：对照组仅含培养液，2.5，5，10，20 mmol/L二甲双胍组。各组细胞离心去上清，残留约50 L培养液，预冷PBS洗涤细胞3次， 加入1 mL 10 mol/L DCFHDA稀释液，重悬细胞，混匀后避光，37 ℃孵育20 min ，无血清细胞培养液洗涤细胞3次，弃去未反应的DCFHDA，再次重悬细胞，用488 nm激发波长，525 nm发射波长，上流式细胞仪检测。实验重复3次。 1.2.6 MTT法检测细胞活性 细胞处理方法与1.2.2相同。实验分组：对照组仅含培养液,二甲双胍组（2.5、、、mmol/L），及二甲双胍（2.5、、、mmol/L）联合NAC（5mmol/L）组。继续孵育24 h 48 h和72h每孔加MTT5 mg/ml)溶液20μl，继续孵育。4 h后弃，每孔加DMSO 100μl，振摇5 min后，570 nm波长下每孔的吸光度( A) 值。