【2017年整理】分子生物学实验指导.docVIP

PAGE PAGE 17 实验1 大肠杆菌感受态细胞的制备 【实验目的】 掌握制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 【实验原理】 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42 本实验以JM109菌珠为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态。 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。利用pBS-T质粒转化制备的感受态菌，可用于所制备感受态菌的转化鉴定。pBS-T质粒携带有氨苄青霉素，可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 【实验内容与方法】 1．感受态细胞的制备 （1）．从新活化的JM109菌平板上挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中（不含Amp），37℃振荡培养12h左右，至对数生长期，将该菌液以1:100～1:50转接于100ml LB培养基中，37℃振荡培养2～3h（OD （2）．将菌液冰浴10min后，转入离心管中，于4℃  （3）. 用10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴15～30min。 （4）．0～4℃，离心4000rpm，10min。 （5）．弃上清液，每50ml初始培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置30min。 （6）．制备好的感受态细胞悬浮液可在冰上放置24h内直接用于转化实验，也可加入1/10高压灭菌甘油, 置-70℃ 2．感受态(JM109)转化鉴定(无菌操作) 1． 取感受态细菌100μl，加入pUC18（或pBR322）质粒(0.3mg/ml)10ul混匀。 2． 冰浴30min后,42℃水浴热休克2min，再于冰浴2min,加入LB液体培养基0.5ml, 37 3．分别取菌液30～100ul加到含Amp的LB固体培养基平皿上， 用三角玻璃刮刀铺板室温放置2min，然后倒置放入37℃ 4．结果分析：在培养基平板上应可以观察到转化子形成的菌落。 【实验准备】 1．LB培养基 取胰蛋白胨2g, 酵母提取物1g, 氯化钠2g, 加水160mL溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0, 2．固体培养基 取胰蛋白胨2g, 酵母提取物1g, 氯化钠2g, 琼脂粉1.2g, 加水160mL溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0 3．0.1mol/L CaCl2 取CaCl2 1.11克加双蒸水定溶至100mL，然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。 【注意事项】 1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。 2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。 3. 应收获对数生长期的细胞用于制备感受态，OD600不应高于0.6。 4. 制备感受态细胞所用试剂如CaCl2等的质量要好。 5. 整个实验一定要在冰浴条件下操作，温度时高时低会影响转化效率。 6．42℃ 【思考题】 何谓感受态细胞？ 2．制备感受态细胞时需注意什么？ 实验2 DNA的转化及阳性克隆的筛选 【实验目的】 学习DNA体外重组技术及转化方法 了解蓝白斑实验筛选转化子的原理和方法。 【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5′端磷酸和3′端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。 体外连接的重组DNA分子必须导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。本实验利用pUC18作为载体，经T4 DNA连接酶作用，将外源基因插入其多克隆位点，构建重组质粒，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，利用蓝白斑实验筛选出转化子。 【实验内容与方法】 将冻存的感受态细胞置于冰上，缓慢解冻； 加入待转化的质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30 min； 42 ℃热激90 s 立即置冰上5 min； 加入无抗性的800 μl LB液体培养基，37 ℃缓慢震荡活化1 h到1.5h 活化好的菌体室