【2017年整理】两虫方法确认材料.doc

PAGE 7PAGE 1生活饮用水中贾第鞭毛虫和隐孢子虫的测定 免疫磁分离荧光抗体法测定方法验证报告（GB/T 5750.12-2006）目的 通过能力确认，确认实验室检出限、回收率，方法重复性方面是否都达到标准要求，实验室是否具备开展用免疫磁分离荧光抗体检测定生活饮用水及水源水的贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测能力。适用范围本标准规定了用免疫磁分离荧光抗体法测定生活饮用水及水源水中的贾第鞭毛虫和隐孢子虫（以下简称为“两虫”）的含量。本标准适用于生活饮用水及水源水中的“两虫”的测定。职责3.1 检测人员负责按操作规程操作，确保测量过程正常进行，消除各种可能影响试验结果的意外因素。3.2复核人员负责检查原始记录。3.3技术负责人负责审核检测结果。测试方法4.1 术语和定义贾第鞭毛虫（Giardia）：一种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫。有两个种，宿主是：G.intestinalis（人类）和G.muris（鼠类）。隐孢子虫（cryptosporidium）：一种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫，有6个种哺乳类动物，包括人类；鸟类；鼠类；爬行类和鱼类。4.2．试剂4.2.1 Easy seed G/C质控标样（贾第鞭毛虫孢囊100±1.6，隐孢子虫卵囊100±1.2）；4.2.2 挪威Dynal贾第鞭毛虫/隐孢子虫免疫磁分离试剂盒；4.2.3 美国Waterborne贾第鞭毛虫/隐孢子虫染色试剂盒；4.2.4 PBS缓冲溶液： NaCl，8g； KCl，0.2g； Na2HPO4，1.15g； KH2PO4，0.24g； 纯水，1000mL，用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2±0.1，在4℃可存储1个星期。4.2.5 PBST淘洗缓冲液：NaCl，8g；，KCl，0.2g；Na2HPO4，1.15g；KH2PO4，0.2g；TWeen-20，0.1mL；纯水1000mL，将磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠加入到900mL超纯水，搅拌20min至完全溶解，加入0.1mLTween-20并继续搅拌10min，然后用超纯水稀释至1000mL；4.2.6 0.1mol/LHCl；4.2.7 1mol/LNaOH；4.2.8 去离子水4.3器材Dynal MPC-1 磁极、Dynal MPC-S 磁极、Dynal MX1 混合器、FM xpressV2.0快速淘洗装置系统、蠕动泵、IKA涡旋震荡混混合器、空气压缩机、四川蜀科离心机、Dynal L10 试管、BK-FL正置荧光显微镜 、移液枪。4.3检验步骤4.3.1水样过滤/淘洗/浓缩过程（Filta）4.3.1.1采样体积 原水20L，处理水100L；根据水样类型决定。将过滤模块（螺栓头朝下）安装在支架上，拧紧盖子（盖子即为进样口）。将过滤装置连接到需采样的水源。中间连接上蠕动泵及流量控制阀4L/min。开动泵，根据水样量来确定采样时间，记下过滤后水的体积V2，单位为L。4.3.1.2淘洗打开压力淘洗器，过滤装置进样口朝上，移开样品阻留器，连接出样口分流装置。将过滤装置倒转，用快接头连接到压力淘洗器上，连接盛有缓冲液的瓶子，加4.0巴压缩空气，。并将500mL锥形离心瓶放置在样品收集器支架上，关闭压力淘洗装置。淘洗装置按控制面板的F1键，开始自动淘洗，2min后收集约500mL的淘洗液。4.3.1.3浓缩将装有淘洗液样本的500mL离心管置2000g离心机离心15min，慢慢减速，并记录下沉淀物体积V0。将沉淀物上层8mL～10mL处的悬浮物小心吸出。4.3.2免疫磁分离（IMS）4.3.2.1使用贾第鞭毛虫/隐孢子虫免疫磁分离试剂盒中的试剂制备1×SL-A型缓冲液，用试剂水作为稀释剂。加1mL10×SL-A型缓冲液和1mL10×SL-B型缓冲液到L10单平面试管中。4.3.2.2定量转移10mL(V1)水样浓缩物再悬浮液到含有SL-缓冲液的L10单平面试管中。4.3.2.3将抗隐孢子虫抗体和抗贾第鞭毛虫的磁微粒原液置于Dynal MX1 混合器上搅拌，以便使珠粒悬浮。并在上述L10单平面试管中各加入100μL上诉述悬浮的微粒。4.3.2.4将样品试管固定到Dynal MX1 混合器，在25r/min的条件下至少旋转1h。4.3.2.5将试管从搅拌器上取下，然后将其放在磁力浓缩器（MPC-1）上，收集磁珠，弃去清液。4.3.2.6将试管从MPC-1上取下，加1mL1×SL-A型缓冲溶液。非常柔和的将试管中的所有物质再悬浮。将样品试管中的的所有液体定量转移到贴有标签的1.5mL微量离心管中。将微量离心管放到另一磁粒子浓缩器（MPC-S)中，对磁珠进行浓缩，再次纯化，并吸走上清液。4.3.2.7加入50μL0.1mol/L