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合 肥 学 院 HEFEI UNIVERSITY 题 目: PCR技术论文 系 别: 生物与环境工程系 专 业:_ 12生物工程2班 学 号: 1202012043 姓 名: 乐一鹏 指导教师: 阚劲松 时间： 2014年11月27日  PCR技术论文 摘要：PCR技术又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具强、灵敏度高、操作简便、省时等特点是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。 1、PCR技术的基本原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定间，使含有所扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，按5到3方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”， 每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2、PCR技术的反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系：　　　10×扩增缓冲液 　 10ul　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至 　 100ul （二）PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：　　①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。　　②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。　　③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。　　④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。　　⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。　　⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子 克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度01