高等真核生物细胞中监测自噬试验方法的解释与使用指南[精选].doc

高等真核生物细胞中监测自噬试验方法的解释与使用指南 摘要 目前有关细胞自噬的研究持续性地增加，不断的吸引许多新的科学家进入这一领域。因此，在不同的生物机体中建立一套标准的监测巨自噬的准则规定，就具有重要意义。最近的很多文献已经描述了已被使用于这一目的的检测范围。有许多有用并且简便的方法可用于监测酵母巨自噬，但在其他模型系统中相对较少；此外，用于测试高等真核生物的巨自噬，存在很多混淆的但看似可接受的方法。需要强调的一个关键问题在于：在测量监测的自噬体数目与测量那些流过自噬途径的自噬体数目之间，存在一定的差异；这样一来，巨自噬堆积，将导致自噬体的聚集作用，需要从完全功能性自嗜的分化作用，其包括输送和降解，以及溶酶体（在大多数高等真核生物中）或液泡（在植物和真菌中）。本文中，我们提出一套指南，用于对这些方法的选择和解释，可供那些试图检测巨自噬及其相关进程的研究人员使用，此外，那些需要对这些研究过程的文章提供实际与合理的批评意见的审稿者也可以使用。本套指南并不意味着是一种公式化的规则，因为适当的检测方法部分地取决于那些所需要解决的问题和正在使用的系统。此外，我们强调，没有任何的检测方法能保证在各种情况下都是最恰当的，我们强烈推荐使用多种检测方式来验证一种自噬反应。 关键词 自噬泡 自噬体 通量 溶酶体 吞噬泡 压力 液泡 在第一次自噬与健康和疾病的Keystone研讨会上，一位坐在听众席的研究员在听了若干细节上不充分的与记录自噬相关的报告后，提出了这样一个问题“证明自噬的最关键的准则是什么？”这是一个理性的问题，特别是考虑到我们每个人对这一问题都有可能有自己的见解。不幸的是，对于那些认为自己可能找到了准则的研究人员来说，这些准则似乎是移动着的目标，他们悲哀的发现评论家们有着不同的观点。相反，作为一个评论家，他们反复的提出相同的反对理由，疑惑为什么研究人员没有达到证实自噬过程存在的基本要求。另外，潜在调控自噬的药物越来越多的应用到临床诊断中，而且用于治疗目的的可调控自噬的新药屏障已经建立起来。显而易见的，基于一套可被接受的准则要求下，确认这些药物是否能够真的影响自噬过程十分重要。因此，我们在此提出一套基本的指南，应用这套指南，研究人员可以计划和阐释他们的实验，临床医生可以决定采用那种方法是最合适的，作者和评论员可以支持或批判某一研究成果。 在为调控自噬选择最合适的方法构建指南的过程中，有几个基本的要点需要谨记。十分重要的一点是对于监测自噬所处的状态没有绝对的准则适用于所有的情况。这是因为有些检验方式是不适宜的，自身存在缺陷的，或者在特定的细胞，组织或器官内根本不起作用。另外，这些指南也许会作为新的方法论而演变发展，取代现有的检测方法。虽然如此，建立一个可被接受的在多种实验系统下均能可靠调控自噬的方法指南十分有用。需要注意的是，在这套指南里，“autophagy”通常代表巨自噬；其他自噬相关过程会在使用时特殊表明。 一个基本的要点是自噬是一个动态的多步骤过程，可以在许多步骤中积极的和消极的调控。从这点来看，自噬的途径和其他代谢途径不存在差别。例如，自噬体的积累（通过电子显微镜图像分析，GFP-LC3荧光亮点分析，或者LC3脂化的western印记分析）可以反映出由于自噬活性的增加引起的自噬体形成的加快或者自噬体消亡的减慢（见图1）。后者是通过抑制自噬体成熟成为自噬泡实现的，抑制是由于自噬体分别脱离了与胞内体或溶酶体的融合，或者是融合后的低效降解而产生的。为了进行综述，自噬过程划分为隔离吞噬泡，自噬体，amphisome（自噬体和胞内体融合的中间囊泡，也可认为是酸性晚期自噬体）和自噬泡（自噬体或amphisomes与溶酶体融合产生的，可以认为是自噬溶酶体）。在这篇评论文章中“phagophore”（吞噬泡）没有暗示自噬体膜的来源的意义。吞噬泡之一术语最初被创造出来是为了指示最初的隔离结构与其他细胞器在形态学上明显不同。其他研究表明自噬体隔离膜的特殊来源最明显的是内质网。实际上，最近的研究工作表明自噬体的形成需要内质网及其他普遍存在的膜结构流经分泌途径。自噬过程中膜的来源的完整理解仍需深入的研究，因此，在本篇文章中提到的吞噬泡仅仅代表一种特殊的结构。 对自噬细胞死亡，或者更确切的说与自噬相关联的细胞死亡（因为鲜有例子表明自噬是导致细胞程序性死亡的机制）的相关研究表明，在另一个重要的情况下，就有必要区分是否出现由于抑制与诱导自噬引起的表型缺陷。在某些情况下，这种类型的死亡是由于自噬通量减少，由于抑制自噬体与溶酶体的融合或降解溶酶体功能的缺失。因此，使用自噬的标记分子，如LC3-II，需要补充对自噬通量的全面了解，以保证对结果有一个正确的解释。在这里，人们需要衡量一般自噬过程中蛋白质的分解率，或在一个给定的点阻止自噬通量，在这一被