小型猪牙本质扫描电子显微镜样本制备与观察及能谱分析.docVIP

小型猪牙本质扫描电子显微镜样本制备与观察及能谱分析 　　摘要：目的 介绍钙化材料扫描电镜的制备方法。方法 取小型猪牙齿标本，经过固定，清洗，脱水，镀膜，然后上镜观察。结果 在扫描电镜下观察取得了满意的图片和能谱信息。结论 通过科学的制备过程钙化材料扫描电镜显微镜取得良好的图像信息。 　　关键词：扫描电镜显微镜；能谱仪；牙本质 　　扫描电子显微镜由于具有分辨率高，放大倍率宽，三维立体成像好，样品制备简单等特点，在各个行业的得到了广泛应用。在医学领域扫描电子显微镜主要用于样品表面结构的超微观察以及通过扫描电子显微镜配套的能谱仪（EDS）检测样品出射的特征X射线，提供材料的化学成分的定性或定量分析结果。由于医学材料具有质地柔软，容易变形，导电性能差，二次电子发射率低以及含水量多等特点，所以生物样品的制备一直是实验中的重点与难点。医学材料主要分为：组织材料（舌，心，血管），钙化材料（牙，骨），液体材料（血液，精子，卵子）。其差异性很大所以相对处理方法也各不相同。以小型猪牙本质小管观察为例，重点说一下钙化材料的制备和观察方法。 　　1实验仪器 　　本次实验需要用到莱卡公司的全自动临界点干燥仪 CPD-300，日本电子公司的离子溅射仪JFC-1600，日本日立公司的扫描电子显微镜S-4800，日本HORIBA公司的X射线能谱仪 EX-350。 　　2样品的预处理 　　2.1取样 实验采用3个月小型猪的牙齿。首先对小型猪麻醉取出牙齿，然后迅速放入液氮中。使其冷冻，变脆，用小锤轻敲，取其牙本质断面较平的直径不超过5mm。高度3～5mm之间的样品块。 　　2.2样品固定与清洗 将样品颗粒放入浓度为2。5%（pH.7.2）中戊二醛中4°C低温条件下固定2h。然后用0.1mol/L磷酸缓冲液反复清洗3次，10min/次。 　　2.3样品的干燥 首先将样品颗粒放入50%酒精中脱水10min，酒精浓度依次增加分别为 70%，80%，90%分别10min，最后使用100%酒精分2次各脱水15min。取出样品放入CPD-300临界点干燥仪中，采用预先设定好的骨质样品干燥流程90min。 　　2.4样品的样品台固定 由于是固体大块样品采用银胶粘合固定导电胶带搭桥的方法，首先在样品台上涂上银胶把样品固定在银胶上，让样品粘牢，冷却5min使银胶变为固态。取两条导电胶带粘在样品表面，注意不要触碰需要观察的部分。这样固定既可以是样品牢固的粘在样品台上，而且上下形成了电子通路从而减少得了样品的放电现象，见图1。 　　图 1 样品固体示意图 　　2.5镀膜 样品呈不规则形大颗粒，需要对样品反复镀膜从而使金颗粒均匀的洒落在样品表面，JFC-1600离子溅射仪采用电流为30，正面时间为40s，周围四面为20s。这种喷金方法可以有效的抑制样品的放电现象，金离子均匀的粘贴在样品表面避免了遮挡要观察的样品表面。 　　2.6样品观察 针对不同材料的样品以及观察内容的不同，观察方法也不及相同。本次实验采用2.0KV的低电压，以及8.0mm高工作距离观察。生物样品观察大小一般在500nm～1mm。所以工作距离不应过于接近样品。8.0mm工作距离即可以清楚的观察到样品表面又可以增加景深凸显图片的三维效果。低电压有利于减少样品的放电效果。 能谱观察需要电镜的高压设为15kv，工作距离设为15mm。 　　3结果 　　3.1由于采用多种方法对样品放电现象进行了抑制。图像没有出现放电现象。样品的牙髓腔，牙髓神经以及牙本质小管都清晰可见，见图2，图3。 　　图2 牙本质包围的牙髓腔与牙髓神经 　　图 3 牙本质小管 　　3.2 对牙本质进行了能谱元素分析，从分析结果来看牙本质主要有元素钙与磷构成。其中钙元素大概含有65%，磷元素大概含有35%，见图4，图5。 　　图 4 样品进行检测的部位 　　图5 样品检测结果 　　3.3 对牙本质元素分布进行能谱分析，从而发现在牙本质上钙与磷均匀分布，而在牙髓腔中磷元素的分布大于钙元素，见图6。。 　　图6 能谱下的钙元素与磷元素分布 　　3讨论 　　扫描电子显微镜作为观察样品超微结构的重要工具其功能变得越来越强大，相对应的样品前期制备过程也在不断的改进。其中制样过程中固定、清洗、脱水，喷金这几步是获得清晰图像的前提。随着人们的不断试验和总结已经形成了相对完善的试验步骤。但还存在很多不足。比如：内脏样品制备，单个血小板的制备，小鼠耳蜗的观察等等。都还需要人们不断的摸索和总结。 　　参考文献： 　　[1]汪克建，廖晓岗，罗子国，等.医学电镜技术及应用[M].北京：科学出版社，2013：90-95. 　　[2]王醒东，张立永，夏芳敏，等.扫描电镜样品的制备技术[J].广州化工，2013（40-1）：46