神经干细胞的分离与培养（比较全）..docxVIP

神经干细胞分离和培养（1）中枢神经系统及外周神经系统中都存在着一类具有自我更新能力和多向分化潜能的神经干细胞，在适当的条件下，可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并表现相应的特化形态结构、表型和生物学特征[1~3]。神经干细胞研究不仅可阐明神经发育的机制，而且在神经系统损伤修复和神经退行性疾病的细胞替代治疗以及基因治疗中都有巨大的应用价值[4~5]。神经干细胞的体外培养、诱导定向分化研究及其在临床上的应用已成为神经科学的一个研究热点。神经细胞具有黏附到它所接触的特异表面的能力，这种能力在它迁移至中枢神经系统适当部位的过程中，以及它的神经纤维延伸至合适的靶位中均起着重要的作用。而这些细胞所接触的一些底物如某些细胞外基质，不仅作为迁移的物理性底物，而且也明显地影响了与其接触的细胞的特性，如细胞的分化等[6]。本研究采用多聚鸟氨酸、层黏连蛋白和鼠尾胶原作为底物诱导神经干细胞的分化和迁移，并比较了这几种底物的作用特点，旨在探讨不同底物对神经干细胞分化的诱导以及对分化后细胞迁移能力的影响。1 材料与方法1．1 材料 动物：出生2~3d的Sprague-Dawley大鼠，由福建医科大学实验动物中心提供。试剂：细胞培养基DMEM/F12、无血清培养基添加剂B27为美国Gibco公司产品，bFGF为美国Pepro Tech公司产品，层黏连蛋白为美国Collaborative公司产品，多聚鸟氨酸、小鼠抗BrdU单克隆抗体购自美国Sigma公司，小鼠抗巢蛋白（nestin）单克隆抗体为美国 PharMingen 公司产品，BrdU购自博士德公司，小鼠抗微管相关蛋白2（MAP2）单克隆抗体、兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、FITC标记二抗、罗丹明标记的二抗均为美国Chemicon公司产品，小鼠抗2，3-环核苷酸二酯酶（CNPas）单克隆抗体为美国Neo Markers公司产品，其他试剂均为美国Sigma 公司产品。鼠尾胶原根据文献[7]的方法制备。1．2 方法1.2.1 神经干细胞的分离和培养 将新生大鼠按常规断头处死，取出大脑组织，置于4°C PBS（pH 7.4 ）漂洗，解剖显微镜下剥离脑膜，切取大脑皮质，用手术刀片将组织切碎，加入少量基础培养液，经200目尼龙网滤过，1000r/min离心10min收集细胞，细胞重悬于含B27和20ng/ml bFGF的DMEM/F12培养液，以2′105个细胞/ml接种于玻璃培养瓶，37°C 5%CO2培养。培养4d后，离心收集未贴壁生长的细胞克隆，更换新鲜培养液，稍加吹打分散成小细胞团，再培养4d后重复此步骤一次，以后每5~7d传代一次，传代采用200目不锈钢网机械法分散细胞。1.2.2 神经干细胞的鉴定 自新能力的鉴定:单克隆化培养的细胞球，加入5mmol/L BrdU培养7d，经4%多聚甲醛和0.3%戊二醛固定后，用抗BrdU抗体进行免疫荧光染色。nestin 表达的鉴定:培养2~3月的细胞经4%多聚甲醛和0.3%戊二醛固定后，用抗nestin抗体进行免疫荧光染色。多向分化能力的鉴定:将培养的细胞球接种于内置盖玻片的培养皿，在所用的培养基中，加入1%胎牛血清或50ng/ml BDNF，培养至第7天用4%多聚甲醛和0.3%戊二醛固定后，采用不同神经细胞特异性抗体进行免疫荧光染色鉴定。分别用抗MAP2抗体鉴定神经元，用抗GFAP抗体鉴定星形胶质细胞，用抗CNPas抗体鉴定少突胶质细胞。经鉴定证实培养的确为神经干细胞后，方用于底物作用的实验。1.2.3 不同底物对神经干细胞分化的诱导 将洗净的盖玻片分别用多聚鸟氨酸（40mg /ml）、层黏连蛋白（10mg /ml）、多聚鸟氨酸（40mg/ml）+层黏连蛋白（10mg/ml）、鼠尾胶原（10mg/ml）进行包被。多聚鸟氨酸的包被：将洗净的玻片插在玻片架上，浸入含有多聚鸟氨酸的0.1mol/L硼酸缓冲液中，于室温包被3~4h，用去离子水漂洗5min共三次，置超净台内自然晾干，紫外线照射30min灭菌后使用。层黏连蛋白包被：将层黏连蛋白溶液滴在洗净已灭菌的玻片上，室温作用1h，将该溶液吸去后即接种细胞。多聚鸟氨酸+层黏连蛋白包被：于细胞接种前1h，将10mg/ml层黏连蛋白溶液滴在已经用多聚鸟氨酸包被并灭菌的玻片上，室温作用1h，将该溶液吸去后即接种细胞。鼠尾胶原的包被：将鼠尾胶原滴在洗净的玻片上，5min后吸去，覆有薄层鼠尾胶原的玻片置超净台过夜晾干，用紫外线照射30min灭菌后使用。取体外培养3~4个月的呈神经球样生长的神经干细胞，稍加吹打分散后，接种于含不同底物包被玻片的培养板中，共为5组：多聚鸟氨酸、层黏连蛋白、多聚鸟氨酸+层黏连蛋白、鼠尾胶原和空白对照组。用1ml含B27和20ng/ml bFGF的DMEM/F12培养液（不含其他分化诱导