全内反射荧光显微镜-北京大学单分子与纳米生物学实验室.ppt

全内反射荧光显微镜 医学实验05级 张园 郑雪飞 宋一萌 解依荻 全内反射显微镜的分型及其结构 全内反射荧光显微镜根据其成像系统的不同可分为棱镜型和物镜型两种类型 （一）棱镜型全内反射荧光显微镜 利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被CCD相机捕捉。 棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图 评价 （二）物镜型全内反射显微镜 收集样品荧光信号的接收器 显微镜的物镜 发生全内反射的光学器件。 由于细胞的典型折射率为1. 33～1. 38 ,因此要想实现全内反射,物镜的NA 必须大于1. 38 。表达式为： NA = nsin（u/2） nsin（u/2） > nsinθc NA 为物镜的数值孔径, n ,u分别为物镜的折射率(浸没油) 和孔径角。θc 为发生全反射的临界角。 二者比较 05级医学实验 宋一萌全内反射荧光显微技术利用全内反射产生的消逝波激发样品，由于消逝波强度成指数衰减，使激发区域限定在样品表面的一薄层范围内，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高信噪比。 当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一 可用来实现对单个荧光分子的直接探测。 全内反射荧光显微镜里用消逝波作为样品的激发光源，并用有着高灵敏度和高时间分辨率的CCD相机(成像速率200Hz)捕捉样品荧光，因此具有如下优点： 1：信噪比高（相对共聚焦显微镜） 2：分辨率高（相对其他的光学显微镜） 3：对生物样本损伤小（相对电镜）可以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。 全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势(它的荧光激发深度只在～100 nm 的薄层范围内),从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。 全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像,大大提高了成像速度,可以满足实时成像的要求;另一方面它的图像解释相对于近场,干涉显微成像来说也较简单。 现在全内反射荧光显微术已被广泛用于 实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动 单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移( FRET) ATP 酶的翻转 聚合物内单个分子的结构变化 生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动 全内反射荧光显微术的发展一方面会在加强传统优势的基础上，即动态观察生物大分子的结构、相互作用、物质的分泌，同时在不断的改进物镜和CCD相机的性能基础上进一步同其他仪器的结合，更多的用在生物细胞活体方面的研究。 全内反射荧光显微术在生物单分子科学中的应用 单分子荧光探测主要有三个问题： （1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。 （2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光，极大的干扰了信号光的探测。所以应该尽量降低背景激发光。 （3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景光。 这些问题都可以利用全内反射荧光显微成像系统来解决 全内反射荧光显微镜可以直接对细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰。 全内反射荧光显微术是研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术 单个的生物大分子的荧光分子特征和动态构像变化要运用到棱镜型的全内反射荧光显微术。 如用环境敏感荧光基团标记的肌球蛋白，然后用分光镜检测。肌球蛋白分子上荧光基团发出的荧光光谱随着时间的起伏现象，说明了自发的肌球蛋白单分子构像改变。 2.蛋白分子相互作用 通过荧光标记的分子共同定位运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。 分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子(co-chaperon)GroES或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分子水平进行了很好的研究。 单配对荧光共聚焦也可以用在单分子水平生物大分子相互作用的成像。 3.离子通道研究 离子通道通过负责神经，肌肉兴奋性细胞的质膜调节离子电流和电化学势。 单分子水平通道电流记录可以通过使用膜片钳方法来检测各种通道的电特性。 目前，已经发展了一种同时可以测电流和荧光信号的实验系统。荧光标记的离子通道蛋白包埋到平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合后来发展的荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，同时可以在体内跟踪构像变化与离子电流。 4.吸附 用于DNA大分子在液-液、固-液界面的单分子吸附行为 。 全内反射荧光显微镜下拍到的位于表面的Actin-YFP和Tubulin-YFP蛋白分子图 分别