第五章原质体培养.pptVIP

* 第五章 原生质体培养 一、原生质体的制备 基础材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化 原生质体活力测定 1、用于分离原生质体材料的准备 无菌试管苗叶片 培养细胞 2、预处理与酶解 材料预处理：子叶、下胚轴;叶片;愈伤组织或胚性悬浮细胞 叶肉原生质体 原生质体分离常用的商品酶 酶 来源 生产厂家 纤维素酶类 onozuka R–10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA 酶溶剂及其渗透压 酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 酶处理： 酶浓度 酶解时间 酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 飘浮法：常用的飘浮剂：蔗糖、Percoll、Ficoll。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。 建立细胞悬浮系 叶肉原生质体分离纯化 Purified protoplasts Leaves were cut in thin stripes and digested in an enzyme solution with mannitol Purification of protoplasts from leaf debris on sucrose gradient. 4、原生质体活力检测 目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。 5、影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶 溶液的渗透压 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持 续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 二、原生质体培养 1、原生质体培养基 无机盐：大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度 有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 激素：常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D 渗透压：常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗 2、原生质体培养方法 液体浅层培养 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。 优点： 操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 液体－固体双层培养 在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。 优点： 固体培养基中的营