酵母三杂交应用及研究进展.docVIP

酵母三杂交系统研究进展 许多生物过程是通过大分子如蛋白-蛋白，核酸-蛋白的相互作用来实现的，对这些大分子间的相互作用的研究有助于揭示生命过程的分子作用机制。酵母双杂交系统是研究蛋白间相互作用的有用工具，随着该系统的广泛应用，在此基础上发展了三杂交系统，研究包括三种成分在内的更为复杂的大分子相互作用，为蛋白-蛋白、RNA-蛋白和小分子-蛋白相互作用的研究提供了新的手段。 酵母三杂交系统的原理 与酵母双杂交系统相同，三杂交系统也是利用转录激活子调控真核基因转录的特点，许多转录激活子由结构上可分而功能上独立的两个结构域组成。如酵母Gal4转录激活子包括DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活域（activation domain，AD）。将DNA-BD与诱饵蛋白X融合，AD与靶蛋白Y融合，分别构建BD-X和AD-Y重组质粒载体，并在酵母细胞中共表达。如果诱饵蛋白X与靶蛋白Y相互作用，DNA-BD和AD相互靠近，重组成有活性的Gal4转录激活子，DNA-BD与上游激活序列（UAS）结合，而AD则激活下游报告基因（如lacZ或HIS3）的转录。通过检测β-半乳糖苷酶活性可确定LacZ基因的表达水平。此外，HIS3编码咪唑甘油磷酸脱氢酶（His3p），能使酵母在组氨酸缺陷培养基上生长。3-氨基-1,2,4三唑（3-AT）是His3p的竞争性抑制剂，His3p表达水平高的细胞能在含有较高3-AT浓度的培养基上生长，因此，酵母细胞对3-AT的抑制水平体现了蛋白-蛋白相互作用的强度。 与酵母双杂交系统不同，三杂交是研究两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个分子使两个杂合蛋白相互靠近。第三个成分不同，可以是蛋白、RNA或小分子。在以蛋白为基础的三杂交系统中，蛋白X与Y的稳定相互作用依赖于蛋白Z的存在，Z介导相互作用或诱导一个蛋白的构象改变（如X），从而促进与另一个蛋白Y的相互作用（图1）。在以RNA为基础的三杂交系统中，DNA结合域（LexA BD或Gal4 BD）与RNA结合蛋白（如MS2-外壳蛋白或Hiv-1 RevM10）融合成第一个杂合蛋白，转录激活域（Gal4 AD）与感兴趣的RNA结合蛋白Y融合成第二个杂合蛋白。第三个杂合RNA分子包含与第一个RNA结合蛋白（MS2或RRE）结合的位点（RNA）以及与RNA结合蛋白Y结合 图1 蛋白三杂交系统 的位点X。蛋白Y与RNA结合位点X结合形成具 Fig. 1 protein-dependent three-hybrid system 功能的转录激活子（图2）。在小分子三杂交系统中，第三个杂合分子为异源二聚化的小分子复合物（如Dex–FK506，DeX-Mtx），使BD-X与AD-Y融合蛋白相互靠近，重新组成具有功能的转录激活子（图3）。在SenGupta等[1] 最早提出的三杂交系统中，第一个杂合蛋白LexABD-MS2由酵母的L-40膜蛋白编码，第二个杂合蛋白Gal4AD-Y由质粒表达，杂合RNA 分子由RNA聚合酶Ⅲ产生，包括RNAse P 5′前导序列和3′尾随序列（位于mRNA终止密码子后）。RNA聚合酶Ⅲ含有一段由4个或多个T残基形成的转录终止子，而许多RNA 结合蛋白识别富含U的RNA靶标，不能被RNA聚合酶Ⅲ转录。Putz等[2]利用RNA聚合酶Ⅱ转录RNA杂合分子，从而避免富含U的靶RNAs成熟前的转录终止。 图2 RNA介导的三杂交系统 图3小分子三杂交系统 Fig. 2 RNA-dependent three-hybrid system Fig. 3 Small molecule three-hybrid system 酵母三杂交系统的应用 2.1 研究蛋白-蛋白之间的相互作用 酵母双杂交系统是检测蛋白-蛋白相互作用的强有力工具，但仅限于研究两个蛋白之间。为了适用于分析三蛋白复合物，Zhang和Lautar[3]发展了三杂交系统，并利用该系统检验了Grb2介导的表皮生长因子（EGF）受体与Sos蛋白（一种鸟嘌呤核苷酸交换因子）的相互作用。Tirode等[4]对三杂交系统进行了改进，将带有Met25启动子的第三个蛋白的基因克隆到已经编码Gal4或LexA融合蛋白的质粒上，Met25是条件型启动子，在缺乏Met的培养基中就可诱导第三个蛋白的表达。这样，就可以利用两个重组载体研究三个蛋白之间的相互作用。在一些情况下