基因组DNA的提取讲解.ppt

核酸的提取技术 主要技术 DNA分子的分离和鉴定 切割技术 载体DNA分离、鉴定 宿主细胞：原核细胞、酵母、真核细胞 DNA导入技术：转化、转染、转导 重组子鉴定：酶切、PCR技术 表达产物的鉴定及活性测定 核酸制备的步骤： 四、注意事项——材料准备 四、注意事项——细胞裂解 四、注意事项——核酸分离、纯化 四、注意事项——核酸沉淀、溶解 五、DNA提取常见问题 五、DNA提取常见问题 五、DNA提取常见问题 * * 基因克隆示意图 核酸的提取 一、实验原理 1、核酸的分类 DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 分离纯化核酸总的原则： ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 2、核酸制备的一般原则 一、实验原理 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解。 3、核酸制备的一般原则 一、实验原理 破碎细胞 提取 纯化 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 ? V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。 4、核酸制备的一般方法和原理 一、实验原理 核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。 核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、0.1%DEPC----焦碳酸二乙酯 核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶 核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯