重组门冬酰胺酶制备表达纯化[精选].ppt

酶类药物--重组门冬酰胺酶Ⅱ表达和制备 门冬酰胺酶Ⅱ L?-天门冬酰胺酶 AnsB?能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酸胺，L?-天门冬酸胺酶将阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。在临床上，L?-天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产，国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品，生产成本高，药价昂贵。基因工程菌产品既能填补国内空白，又能大幅度降低生产成本。 参考文献 1重组与表达 刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清.《大肠杆菌L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达 》中国药科大学生物化学教研室, 南京210009南京铁道医学院生物化学教研室, 南京210009 2提取与纯化 刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐.《大肠杆菌L门冬酸胺酶的提取和纯化》中国药科大学生化教研室, 南京210009 重组与表达 材料 限制酶 Ncol?、Hind?III及T 4 DNA?连接酶，购自 Promega?公司；Taq?酶、dNTP?、IPTG?购自华美公司；丙烯酰胺、N , N’?-甲叉双丙烯酰胺、SDS购自sigma?公司。pKK 233?-2?购自clonetech?公司；pKK 233?- ansB?是将代PCR?扩增得到的AnsB?基因DNA?用 Ncol ?和Hind?III消化后，定向插入pKK 233?-2?的多克隆位点而得到的重组质粒。 实验方法 PCR扩增AnsB基因 重组质粒PKK233-ansB 的构建 阳性转化子的筛选 PCR扩增AnsB基因 模板的制备：用接种环挑取CPU 210009菌体少许，在裂解液(1﹪TritonX-100,2mmol/LTris-HCl pH8.5 ,2mmol/L EDTA)1ml中振散，95C加热处理液10min,吸取处理液5ul用于PCR。 引物：E1: 5‘-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC?一3′ E2: 5′-GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC?一3 ′? 11：5′-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC一3′ 12 : 5′-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG?一3 ′ 扩增条件：84C变性1 min ; 60C复性2 min ; 72C延伸1 min?；循环28次。 重组质粒PKK233-ansB 的构建 PcR?扩增后的DNA片段及质粒pKK 233?-2?同时分别用限制酶Ncol?和Hindl?消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的DNA?片段和电泳回收的质粒大片段用T 4.DNA?连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化HB 1 01?、71 / 15?、ATCc 9637?、JM107?、cPU 210009?，筛选获得相应的阳性转化子。 阳性转化子的筛选 将涂布在含氨节青霉素的LB?平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB?平板上，为每个克隆编号。平板置37C?温箱中过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量菌体，移入预先加有0 . 1 mol/ L?硼酸缓冲液（pH 8 . 4 ) 50ul的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔各加入0 . 04 mol / L?天门冬酞胺底物溶液50?ul , 37C?保温15 min?，加奈氏试剂50?ul，呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。 条件选择 提取纯化 蔗糖溶液提取法 L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析） 酶活力的测定 酶分子量测定 L-天门冬酰胺的提取（蔗糖溶液提取法） 向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液（蔗糖40﹪，溶菌酶200mg/L,EDTA 10mmol/L,pH7.5.）在30C震2小时，8000r/min离心30min,收集上清酶液。 L-天冬氨酸酶的纯化 蔗糖溶液提取法获得的酶液, 加入硫酸铵至55﹪饱和度，调pH至7.0, 室温搅拌1小时, 离心除去沉淀。上清液中加入硫酸铵到90﹪饱和度，离心收集沉淀。沉淀物用50mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用10mmol/L、pH7.6的磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素DE52层析柱（1.0×30cm） 。用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱, 流速为40ml/h。每分钟收集一定的洗脱液并于280处测定紫外吸