大肠杆菌感受态细胞的制备..docxVIP

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化周韬 摘要：本实验采用CaCl2的方法将大肠杆菌进行了感受态处理，并进行pBS质粒的转化，转化结果用对卡那霉素的抗性为评估指标。关键词：大肠杆菌，感受态，质粒DNA转化。引言： 图 2 不同转速不同时间下E.coli DH5α菌株的OD600值图 1 E.coli DH5α菌株在不同生长阶段的电转化效率图朱森康[1]等人在“制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究”中的到了图1的结论。不同生长阶段所制备的电转化感受态细胞转化效率存在明显差异，在OD600为0. 452 时出现一个转化效率峰值。而吴海燕[2]等人在“快速准确制备大肠杆菌高效感受态细胞中有关OD600值的探讨”中，在不同转速条件下测定OD600和转化时间的关系，得到了如图2的结果。从图2中可以看出在不同转速条件下，OD600达到0.45左右所花的时间都在2~3h之间。所以，本次实验培养2~3h，可以认为OD600达到要求。1、实验部分1.1原理质粒DNA转化之后可以再宿主细胞稳定的遗传给后代，使宿主细胞表现更多本来没有的形状。将质粒载体转移进受体细胞，需要将细胞诱导产生一种短暂的感受态状态，此过程有CaCl2处理法和电击法，本实验采用CaCl2处理法。经过冰冷CaCl2溶液处理过及短暂热休克后，细胞容易被DNA感染。本次实验采用E.coli DH5α菌株作受体细胞，处理为感受态后与pBS质粒共保温，实现转化。转化后的细胞培养出的子代能够表达pBS质粒DNA基因，其中含有卡那霉素抗性基因，所以可以通过卡那霉素筛选出转化成功细胞的子代细菌（为转化成功的细菌不能生长）。为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个因素：（1）细胞生长状态和密度：不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养菌，最好从-70℃甘油保存菌种中直接接种用于制备感受态细胞的菌液。（2）质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率和外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会下降。一般，DNA溶液的体积不超过感受态细胞体积的5%。（3）试剂的质量：所用的试剂都要求是最高纯度的，并用超纯水配制。（4）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。1.2试剂与仪器1.2.1试剂LB培养基：在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl，用1mol.L-1 NaOH调pH至7.2，加水至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。卡那霉素储存液：浓度100mg.mL-1。LB固体培养基：1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌。1 mol.L-1CaCl2储存液：使用浓度为0.1 mol.L-1。1.2.2仪器恒温摇床，CO2细胞培养箱，太石高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，移液枪，Eppendorf管。1.3实验步骤（1）感受态细胞的制备。从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3~5mL LB培养基中，37℃下振荡过夜培养12h，直至对数生长后期。将悬液以1:50（体积比）接种于5mL LB培养基中，37℃振荡培养2~3h至为0.5左右。将5mL培养液转入1.5mL离心管，冰上放置10min，与4℃下5000rpm离心5min。弃去上清液，用预冷的2mL 0.1 mol.L-1 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，分为两管，在冰上放置10-15min，4℃下5000rpm离心5min。弃去上清液，加入0.2mL 0.1 mol.L-1 CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，每管再分为两管（都是均分），冰上放置几分钟。（2）铺平板。将配好灭菌的LB固体培养基加热熔化，待冷却至60℃左右，加入适量与培养皿中，向三个培养皿中加入159μL卡那霉素，另外一个不加抗生素。（3）感受态细胞的转化。4个管中，分别向两个管加入5μL质粒DNA溶液，另外两个管加入等量无菌水，轻轻摇匀，冰上放置30min。42℃热水浴中热击90s，迅速置于冰上放置3-5min。向管中加入400μL无抗生素的培养基，混匀37℃振荡培养1h左右。将上述菌液摇匀，分别将加入质粒DNA的菌液和其中1份加无菌水的菌液，取200μL涂布于含卡那霉素的筛选平板上。另一份加无菌水的菌液取稀释20万倍，取200μL涂布于不含抗生素的筛选板上。正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收之后，倒置培养皿，37℃培养16-24h。2、实验结果和分析两组进行质粒DNA转化的培养皿上，菌落数量