医学免疫学实验Djp4免疫标记技术选读.pptVIP

* * * * * 免疫标记技术 免疫标记技术 概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原 用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。 特点：敏感、特异、快速， 定性、定量、定位。 ★免疫印迹技术(western blot) ★斑点金技术 ★放射免疫技术 ★酶免疫技术（ELISA） ★免疫荧光技术 常用免疫标记技术： 直接免疫荧光 荧光素直接标记抗体, 检测抗原。 Ag Fluorochrome Labeled Ab Tissue Section 常用的荧光素主要有： 异硫氰酸荧光素(FITC)：黄绿色 藻红蛋白(PE)：桔红色 罗丹明（RB200)：红色 免疫荧光技术：直接免疫荧光，间接免疫荧光 间接免疫荧光, 一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。 Ag Fluorochrome Labeled Anti-Ig Tissue Section Unlabeled Ab 高效、更灵敏 2. 经济、通用性强 一抗： 二抗：以兔源一抗为例 兔源一抗 木瓜/胃蛋白酶 抗体Fc段（为抗原） 人蛋白：1，2，3 …… 兔/鼠： 抗体1，2，3 ……… 羊（驴） （二抗） 免疫动物 产生抗体 多抗/单抗 兔源/鼠源抗人 抗原 种特异性：一个羊源二抗可识别所有兔源一抗，即一个二抗分子可识别一种动物源的所有一抗。 羊抗兔/鼠；驴抗兔/鼠 免疫羊 产生抗体 恒定区 可变区 人工制备抗体的类型 多克隆抗体 　抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血清），含有针对不同抗原决定簇的多种抗体分子。 Ag * 抗原决定簇 单克隆抗体（mAb) K?hler 和 Milstein 1975年建立的技术，通过杂交瘤技术获得的针对单一抗原决定簇的高特异性抗体。 * * 抗原加工提呈，抗原肽 免疫荧光技术 抗C3二抗 补体结合位点 见前所述 定位： 对某蛋白质在细胞的定位、定量（细胞质中表达） 荧光染料 共定位： 对某二个蛋白质 在细胞内的定位、 定量 免疫荧光可“定位” 、“定性” ，借助图像软件可进行模拟“定量”分析； 酶标记技术 免疫组织化学：“定位” “定性”、“模拟定量”； 免疫印迹（Western blotting）：“定性”、“模拟定量”； 酶联免疫吸附试验（ELISA） ：“定量” 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 (OPD) 邻苯二胺(OPD) 四甲基联苯胺(TMB) + H2O2 有色物质 直接法direct ELISA 检测抗原： 酶直接标记一抗 辣根过氧化物酶(HRP) TMB/OPD + H2O2 有色物质 抗原 一抗 邻苯二胺(OPD) 四甲基联苯胺(TMB) 酶联免疫吸附试验Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) 双抗体夹心法Sandwich ELISA 检测抗原： 有两个一抗。 固相载体： 聚苯乙烯微量反应板 辣根过氧化物酶(HRP) 间接法indirect ELISA 病人血清 固相载体： 聚苯乙烯微量反应板 （工业化生产）已知抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)， 二抗： 抗人IgM 或 IgG Fc段抗体 如：检测乙肝表面抗体(HBsAb) ① ②加病人血清 ③ 辣根过氧化物酶(HRP) 包被 洗涤 洗涤(可省) 洗涤(不可省) 有色物质 二抗过量 时，加入 病人血清 后，要不 要洗涤？ 邻苯二胺(OPD) 四甲基联苯胺(TMB) TMB/OPD + H2O2 预包被板 空白 阴性 阳性 待测1 待测2 间接ELISA法检测血清抗-HBsAb 1.加血清及对照(一抗) 第1孔，空白对照，加洗涤液1滴 第2孔，阴性对照，加阴性对照血清1滴 第3孔，阳性对照，加阳性对照血清1滴 第4孔，待检血清1，加待检血清1滴 第5孔，待检血清2，加待检血清1滴 (不洗，因为二抗过量) 2.加酶结合物 (酶结合二抗) 加入酶结合物1滴（空白孔不加），混匀，37?C ，20-30min 3. 洗板:弃去孔内液体，注满洗涤液，静置5sec甩干，重复3次。 4.显色:每孔加显色液A、B各1滴，混匀，封板，37 ?C ，15min 5.观察结果： 预包被板：已经包被HBsAg TMB/OPD + H2O2 邻苯二胺(OPD) 四甲基联苯胺(TMB) 酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法) * * * * * * * 啤酒酵母（綠）被樹突細胞（紅：細胞膜；藍：細胞核）吞噬及破壞的過程圖示（顯微圖片由E