第十二章基因诊断.doc-中南大学网络教学平台.docVIP

中南大学生物科学与技术学院 分子生物学研究中心 教 案 授课科目: 授课内容:授课对象：临床医学年制年制授课时数：学时授课：授课地点：授课时间：多媒体教学多媒体课件中南大学课科目: 授课内容:授课对象：临床医学年制授课时数：学时授课： 授课地点：教室授课时间：200年月日月日多媒体教学多媒体课件DNA分子在某些理化因素作用下解旋，条件恢复后又可依碱基配对规律形成螺旋结构。来源不同、具有互补碱基序列的核酸（DNA或RNA）单链在适宜条件下可按碱基配对规则通过氢键结合在一起形成双链结构，选用已知顺序核酸片段作为探针，标记后与未知核酸链进行杂交反应，分离已杂交和未杂交的标记核酸片段，通过标记信号的检测就可以对未知的目的核酸链进行定性、定量分析。 核酸杂交分析的基本过程：（1）Preparation of Samples and Probes；（2）Prehybridization and Hybridization；（3）Detection and Analysis of the Result 1．制备合适的探针是核酸杂交用于基因诊断的关键： What is a probe? DNA, cDNA, RNA, Oligonucleotide 探针由核苷酸链和可示踪的标记物两部分组成。 不同探针在应用中各有特点，但最重要的都是探针序列的选择，合适的探针序列是基因诊断准确、特异、简便、可靠的基础。 2．不同形式的核酸分子杂交可用于不同的诊断目的：Southern blot vs.Northern blot; Dot hybridization vs.Reverse dot hybridization Southern blot一般过程： 提取DNA→ 限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段→凝胶电泳分离（DNA分子有其独特的限制性酶切图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带）→变性处理→DNA转印到膜上并使其牢固结合→预杂交及杂交→结果检测与分析 图示：核酸杂交结果分析 原位杂交（in situ hybridization）FISH: fluorescence in situ hybridization （第一学时）PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程 理论上，从一个模板分子起始，经过n次聚合反应后可合成2n个分子。如进行30轮扩增，则可合成出230，即109个待检分子；对一段500bp的DNA片段来说，约等于1 μg 。 PCR在基因诊断中的作用：放大待诊信号，提高检测灵敏度。从极少样品即有可能扩增出电泳后肉眼可见的产物。 用于临床疾病诊断，可进行已知序列或已知部分序列基因的检测，并可与其他技术方法结合使用，成为多种基因分析方法的基础。 直接采用PCR技术进行基因诊断： 依据：特异性扩增产物的有无 2．采用PCR产物的限制性长度多态性分析进行基因诊断（PCR-RFLP) RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism 通过PCR将包含待测位点的DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制性内切酶水解，根据限制性片段数量和长度变化进行判别。 3. 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针斑点杂交进行基因诊断(PCR-ASO，PCR-DB)：适用于突变位点已知的情况。 ASO: Allele Specific Oligonucleotide 针对已知突变分别合成一对寡核苷酸探针，其中一个为野生型，另一个为突变型。 4. 通过PCR产物的反向点杂交分析进行基因诊断（PCR-RDB ） RDB: Reverse Dot Blot 5. 采用PCR产物的单链构象多态性分析进行基因诊断（PCR-SSCP) Single-strand Conformation Polymorphism 图示：PCR-SSCP分析原理 6. 采用PCR结合变性梯度凝胶电泳分析技术进行基因诊断（PCR-DGGE） Denaturing Gradient Gel Electrophoresis 7. 用甲基化特异性PCR进行基因诊断 Methylation specific PCR, MS-PCR 模板甲基化处理，C-U 需设计特异性甲基化引物G:C/A:U 8. 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析 Q-PCR, Quantitative PCR 基本原理：PCR指数扩增规律 N=N0(1+E）n （1）通过测定PCR产物量对靶核酸进行定量分析