一.RNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的掌握植物总RNA非变性胶.docVIP

一. RNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的????掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。 二、实验原理???RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。三、实验材料、器具及药品?蘑菇的总RNA溶液。?电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。?琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。? 四、实验步骤?（1）用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl?1×TAE电泳缓冲液及1μl?的10×载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。 RNA的变性琼脂糖凝胶检测?试剂：?（1）MOPS缓冲液（10×）0.4mol/L?吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(7.0)，0.1mol/L?NaAc,?10mol/L?EDTA。（2）上样染料：50%甘油，1mmol/L?EDTA?0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。?（3）甲醛。（4）去离子甲酰胺v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。 操作：? （1）?将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。? （2）?配制琼脂糖凝胶。? 称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml?锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。? 待胶凉至6070?℃，依次向其中加入9ml甲醛、5ml?10×?MOPS缓冲液和0.5ul?溴化乙锭，混合均匀。? 灌制琼脂糖凝胶。 ?（3）?样品准备：? ?????取DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂：?10x?MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul甲酰胺（去离子）10ulRNA?样品4.5ul混匀。? ?????将离心管置于60水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。? ??????向管中加入3ul?上样染料，混匀。（4）上样。 （5）电泳：电泳槽内加入1×MOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。 （6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。 RNA电泳（甲醛变性电泳） 【目的】?将DNA/RNA通过凝胶电泳使之在凝胶中分离出来，通过加入标准核酸分子（markers）对其进行鉴定，并用于转膜、杂交等。 【试剂】 10×MOPS缓冲液： ?????0.2mol/L?MOPS（3-〔N-吗啉〕丙磺酸） ?????80mmol/L?NaAc ?????10mmol/L?EDTANa2 ????先用400?ml?DEPC水溶解20.6g?MOPS和4.1g NaAc后，加入10ml?0.5mol/L?EDTA，定容500ml。用0.22mm滤器过滤除菌，避光保存。 1×MOPS电泳缓冲液： ??????????10×MOPS??????150ml ??????????37%甲醛????????80ml ??????????加水至1500ml。 甲醛凝胶变性RNA电泳加样缓冲液（10×）： ???????50％甘油 ???????1mmol/L?EDTA ???????0.25％溴酚蓝 ???????0.25％二甲苯青FF ????5ml甘油、20ml?0.5mol/L?EDTA、25mg溴酚蓝、25mg二甲苯青FF，加DEPC水至10ml，高压后，4°C保存。 5mol/L?EDTA（pH8.0） 37％甲醛、甲酰胺等。 【操作步骤】 1．??电泳槽用0.3%H2O2浸泡30min，DEPC水冲洗晾干。 2．??铺胶（20ml） ??琼脂糖??????????0.24g??（1.2%） ??无RNase水?????17.4ml ??10×MOPS???????2.0ml ??37%甲醛?????????0.6ml ??EB???????????????1ml ????将琼脂糖加水融化后，加10×MOPS，待胶冷却至60°C左右，再加甲醛和EB。（若铺大胶可将上述各试剂的量加大2倍）。? 3．??RNA样品处理（以一条泳道为例）?4．加2.0ml甲