分子信标的原理、应用及其研究进展.docVIP

分子信标的原理、应用及其研究进展 翟士桢 （基础医学院 生物物理学系） 摘要 分子信标技术是一种基于荧光共振能量转移现象（FRET）和碱基互补配对原则建立 起来的一种分析技术。分子信标作为一种荧光标记的分子探针，具有极强的特异性和较高的 灵敏度，目前已经成为基础医学和生物学的重要研究工具。本文着重介绍了分子信标的基本 原理及其应用，并对其近年来的研究进展做以简单介绍。 1 引言 在基因时代和蛋白质时代，人们迫切需要一种具有高灵敏度和高亲和力的生物分子探 针，用以进行定性和定量检测。1996 年Tyagi 和Kramer 首先建立了分子信标技术，很快这 种技术就广泛的应用于医学、生物学、分子生物学、临床医学和化学等诸多领域。分子信标 技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至 可以用于活体分析。在临床诊断、基因检测等领域，分子信标也越来越显示出它的优势。近 年来，人们对分子信标的结构作了诸多改进，发展出很多具有更多特性的新型分子信标。随 着分子信标的发展，该技术也必将在更多领域中发挥出它的优势。 2 分子信标的原理 分子信标是一种荧光标记的寡核苷酸链，一般含有25～35 个核苷酸。在结构上，分子 信标大体上可以分为三部分：（1）、环状区：一般由15～30个核苷酸组成，可以与靶分子特 异结合；（2）、茎干区：一般由5～8个碱基对组成，在分子信标与靶分子结合过程中可发生 可逆性解离。（3）、荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般连接在 5ˊ端；淬灭基团一般连接 在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。根据Foerster 理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比。所以只有荧光基团与淬灭基团之 间达到一定的距离时才会产生荧光。 自由状态时，分子信标呈发卡式结构，从而荧光基团和淬灭基团相距较近（约7～10nm）。 此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧 光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标与靶分子结合时，荧光基团和淬灭基团之间 的距离加大，从而，分子信标的荧光几乎 100%恢复。而且所检测到的荧光强度与溶液中靶 标量成正比。 3、影响分子信标的主要因素 分子信标中，荧光基团和淬灭基团之间的距离是影响分子信标的最主要因素。根据 Foerster 理论，荧光基团与淬灭基团之间的距离直接影响荧光的强度。 另外，温度也是影响分子信标的一个重要因素。在较低温度下，分子信标才可以保持发 卡结构。在较高温度下，分子信标将无法保持其发卡结构，甚至使其伸展为随机线状，造成 荧光基团和淬灭基团分离，从而发出荧光，出现假阳性结果。有文献表明，其熔链温度取决 于茎干区的长度、G-C 含量和缓冲液的离子强度。  Bonnet 等研究温度对分子信标影响时发现，体系的荧光强度呈现为一个先减弱后增强 的过程。就此，Bonnet 等做出如下解释： 在较低温度下，分子信标与靶标结合呈S1 状态，发出荧光。随着温度升高，分子信标 与靶标分离，分子信标重新恢复为发卡式结构即S2 状态，从而荧光强度减弱。温度持续增 高，将导致分子信标熔链即S3 状态，荧光基团与淬灭基团分离，导致荧光恢复。 环境 pH 值也是影响分子信标的一个因素。pH 值过高，分子信标的发卡结构可能被破 坏，出现假阳性结果。此外，分子信标的纯度，也将对分子信标产生影响。 4、分子信标技术在基础医学中的应用 分子信标技术最初被用作PCR 的荧光探针，它既可以对扩增产物进行定量检测，又可 以对扩增过程进行实时的检测。近年来，随着分子信标技术的发展和成熟，人们不断开拓其 应用领域，目前，分子信标不仅可以用于基因的定量、定性检测，还可以用于基因点突变等 的分析，将分子信标与PNA-DNA-环技术结合，使检测双链DNA 成为可能。另外，分子信 标技术还为研究DNA-蛋白质之间的相互作用提供了一种简单、直接、灵敏、实时、甚至可 以用于活体检测的方法。利用分子信标技术在分析、检测核酸和蛋白质中的优点，分子信标 技术还可以作为生物芯片和生物传感器的探针。总之，分子信标技术已经广泛的应用在基础 医学研究中的众多领域。 实时定量PCR测定靶标浓度 分子信标技术在其出现之初就被用于实时定量PCR测定靶标浓度。这一技术是基于荧光 信号积累实时检测整个PCR进程。它是在常规的PCR的基础上加入相应的分子信标，在PCR 的每一循环过程中，都会发生分子信标与扩增产物结合，从而产生荧光，但这并不影响PCR 的整个过程。并且只有能和分子信标结合的DNA模板得到扩增时才能产生荧光信号。所以荧 光强度与特异性扩增产物的量成正比，它是模板被PCR扩增的直接标志。与常规的核酸检测 方法相比，分子信标可以进行闭管操